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.2010年6月1日；184(11):6177-87.
doi:10.4049/jimmunol.0904085。 Epub 2010年5月5日。

p53通过抗氧化功能抑制类开关重组为IgG2a

Jeroen E J吉克马 1, 卡罗尔·施拉德, 迈克尔·H·布罗茨基, 艾琳·K·莱尼汉, 亚当·理查兹, 纳赫拉·埃尔·法拉基, 丹尼尔·H·李, Hayla K Sluss公司, 伊娃·绍莫拉尼·祖达（Eva Szomolanyi-Tsuda）, 珍妮特·斯塔夫内泽
附属公司

p53通过其抗氧化功能抑制IgG2a的类开关重组

杰罗恩·E·J·吉克马等。 免疫学杂志. .

勘误表in

  • 免疫学杂志。2011年11月1日；187(9):4920

摘要

Ig类开关重组（CSR）发生在活化的成熟B细胞中，并导致IgM同型与IgG、IgE或IgA同型交换，从而提高体液免疫反应的有效性。重组需要在发生CSR的重组开关（S）区发生DNA ds断裂。激活诱导的胞苷脱氨酶通过S区胞嘧啶的脱氨基作用，启动DNA ds断裂形成。该反应需要活性氧（ROS）中间体，如羟基自由基。在本研究中，我们发现ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸抑制CSR。我们还证明，用于诱导IgG2a转换的IFN-gamma治疗增加了细胞内ROS水平，并激活了转换B细胞中的p53，并且表明p53通过其抗氧化调节功能抑制IgG2a类转换。最后，我们发现p53抑制了发生CSR的B细胞S区的DNA断裂和突变，表明p53抑制激活诱导的胞苷脱氨酶的活性。

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数字

图1
图1。p53缺乏的脾B细胞在培养中显示IgG2a转换增加
CFSE负载的脾B细胞来自p53−/−和野生型同窝小鼠与脂多糖、细胞因子和/或抗δ-右旋糖酐培养2.5天，以诱导Ig类转换为指示的同型。（A） 流式细胞术检测细胞CSFE稀释度和表面Ig；示出了代表性的FACS图；开关单元的百分比显示在门内。（B） 来自8个实验（8组小鼠）的数据被归一化为野生型同窝鼠（WT）的交换百分比，显示为100%。接入平均百分比p53−/−显示了不同同型物相对于WT（+SEM）的变化。显著性由一个样本确定t吨测试。
图2
图2。多瘤病毒感染p53−/−小鼠体内IgG2a转换增加
p53−/−,援助−/−和野生型同窝小鼠腹腔接种2×106多瘤病毒A2株pfu。接种后12–20天，通过流式细胞术分析脾脏生发中心B细胞的表面同型表达。（A） FACS图显示了感染后14天采集细胞的实验中B220+GL7+脾B细胞表面Ig的表达。在门的旁边描绘了切换单元的百分比。（B） 数据点和条代表单个小鼠和平均值（野生型n=7，野生型n=5p53−/−)B220+GL7+脾生发中心B细胞亚群内的同种型转换细胞百分比。使用3、2和2只野生型小鼠、1、2和p53−/−小鼠，在第二个实验中（如图所示）2援助−/−包括小鼠。重要性由Mann-Whitney决定U型测试。
图3
图3。Nutlin-3治疗抑制多个同型细胞的CSR而不影响细胞增殖
CFSE负载的野生型脾脏B细胞被激活以进行CSR至所指示的Ig同种型。在培养开始时添加2.5µM Nutlin-3或溶剂对照（DMSO）。培养2.5天后，通过流式细胞术检测表面Ig来评估等级转换。（A） 4个实验的数据被归一化为未经处理的（DMSO）脾B细胞的转换百分比，显示为100%。显示了Nutlin-3处理的脾B细胞相对于未处理的不同同型细胞的平均转换百分比（+SEM）。显著性由一个样本确定t吨测试。（B） 图中显示了用2.5µM Nutlin-3（蓝色轮廓）或DMSO载体对照物（红色轮廓）处理后激活的脾B细胞转换为所示同种类型的重叠CSFE直方图。
图4
图4。S区域DSB增加p53−/−脾B细胞诱导IgG2a转换
对野生型（WT）分离的GAPDH标准化DNA的三倍稀释液进行Sμ和Sγ2a LM-PCR，p53−/−、和援助−/−用LPS+IL4或LPS+IFNγ刺激脾脏B细胞2天。分别使用5’Sμ或5’Sγ2a引物，结合结合物特异性引物，对Sμ和Sγ2a中的钝性DSB进行评估。PCR产物分别用内部Sμ或Sγ2a探针进行印迹和杂交。（A） 激活细胞内SμDSB进行IgG1转换。（B） 激活细胞内SμDSB进行IgG2a转换。（C） 激活细胞内Sγ2a DSB进行IgG2a转换。（D） 条形图描绘了放射自显影膜的密度测量平均值（+SEM），标准化为WT，设定为1.0（所有实验的n=4，IgG2a条件下的Sγ2a DSBs除外，n=3。）将所有3个滴定道一起扫描。每个重复实验都是在一组单独的小鼠身上进行的。使用两组小鼠进行了两项独立实验。（E） WT和p53−/−脾B细胞被激活以进行IgG3转换。绘制WT（黑条）和p53−/−（白条）每50个核苷酸片段的突变频率。总突变频率增加了3.1倍p53−/−与重量相比（p=0.00001）。WT的总突变/核苷酸分析：31/10231；对于p53：30/3182。
图5
图5。IFNγ+LPS激活转换B细胞中的p53
（A） 体外脾B细胞中Ser18磷酸化p53（pSer18）的Western blot分析，用LPS+抗δ-右旋糖酐或LPS+反δ-右旋糖苷+干扰素γ刺激B细胞2天。以5Gy照射活化的脾B细胞作为阳性对照。Gapdh用于蛋白质负荷控制。这个实验进行了两次，每次使用一只老鼠的细胞。（B） 定量PCR分析LPS+抗δ-右旋糖酐或LPS+反δ-右旋糖苷+干扰素γ刺激48小时后WT脾B细胞p21 mRNA表达。用2.5µM Nutlin-3处理的细胞作为阳性对照，p53−/−单元格作为阴性对照。条形图描述了用LPS+抗δ-右旋糖酐刺激的野生型脾B细胞的相对p21 mRNA丰度。显著性由一个样本确定t吨测试。使用4组小鼠进行了四项独立实验。（C） 定量PCR分析受刺激的WT脾脏B细胞中与hprt mRNA相关的倍体蛋白1 mRNA表达，以转换为方法中所述的指示同种型。数据来自一个实验，PCR一式三份。
图6
图6。p53 Ser18磷酸化调节IgG2a转换
将p53S18A和野生型对照小鼠的CFSE负载的脾B细胞与LPS、细胞因子和/或抗δ-右旋糖酐培养2.5天，以诱导Ig类转换为指示的同种型。通过流式细胞术测定表面Ig染色的类别转换。（A） 显示了具有代表性的FACS图。上部面板显示来自相同群体的野生型小鼠和p53S18A脾脏B细胞的CFSE负荷相等。开关单元的百分比显示在门内。（B） 条形图描绘了来自4组小鼠的数据，这些数据都在一个实验中进行了分析。图中显示了不同同型的p53S18A中CSR相对于WT（+SEM）的百分比。显著性由一个样本确定t吨测试。
图7
图7。切换ROS增加p53−/−脾B细胞；NAC抑制CSR并消除增加的IgG2a开关p53−/−脾脏B细胞
（A） 所示为野生型（红色剖面）和p53−/−装载CM-H的（蓝色剖面）脾B细胞2-用LPS+抗δ-右旋糖酐+干扰素γ激活48小时后的DCFDA荧光ROS探针。用10 mM（蓝色剖面）和20 mM NAC（绿色剖面）处理可降低激活野生型和p53−/−脾B细胞。（B） 激活CFSE负载细胞进行IgG2a转换，并用10 mM NAC处理。2.5天后通过流式细胞术检测表面Ig染色来评估IgG2a的转换。显示了3个独立实验的典型FACS图。门内给出了IgG2a开关细胞的百分比。（C） 用LPS+细胞因子和/或抗δ-右旋糖酐激活CFSE负载的野生型脾B细胞，以将CSR诱导至指示的Ig同种型。采用流式细胞术检测CSR表面Ig染色。开关单元的百分比显示在门内。顶行显示未经处理的对照培养物，中间行显示用10 mM NAC处理的培养物。底行显示对照培养物（红色图谱）和10mM NAC处理的培养物（蓝色图谱）中的CSFE荧光的叠加直方图。给出了三个实验的典型FACS图。（D） 条形图显示了3个实验中未处理细胞的数据，显示为100%。显示了NAC处理的培养物中与未处理培养物相比的切换细胞百分比的平均值（+SEM）。显著性由一个样本确定t吨测试。（E） 对野生型和野生型Gapdh标准化DNA的三倍稀释液进行SμLM-PCR援助−/−用LPS+抗δ-右旋糖酐（含或不含10 mM NAC）激活脾B细胞2天。对LM-PCR产物进行印迹并与内部Sμ探针杂交。对代表三倍稀释度的所有三条车道进行密度扫描。将未经处理的样品设置为1.0，以确定相对密度。给出了两个实验的典型结果。
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