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.2010年7月；30(14):3503-18.
doi:10.128/MCB.00290-10。 Epub 2010年5月17日。

组蛋白H2B核心结构域中的新功能残基调节酵母基因表达和沉默，并影响对DNA损伤的反应

麦肯纳·N·M·克里斯 1, 易进, Isaura J Gallegos公司, 詹姆斯·桑福德, 约翰·J·威里克
附属公司

组蛋白H2B核心结构域中的新功能残基调节酵母基因表达和沉默，并影响对DNA损伤的反应

麦肯纳·N·M·克里斯等。 分子细胞生物学. 2010年7月.

摘要

以前的研究已经确定组蛋白H2B核心折叠结构域中存在新的修饰，但对这些假定的组蛋白修饰位点的功能知之甚少。我们已经突变了保存在酿酒酵母组蛋白H2B中的核心可修饰残基，并描述了突变对酵母沉默、基因表达和DNA损伤反应的影响。我们确定了三个组蛋白H2B核心可修饰残基具有重要功能。我们发现在酵母中突变H2B K49可产生紫外线敏感性表型，并且我们确认人类组蛋白H2B中的同源残基在人类细胞中被乙酰化和甲基化。我们的结果还表明，H2B K111突变会损害对甲基甲磺酸甲酯（MMS）诱导的DNA损伤的反应，并破坏端粒沉默和Sir4结合。相反，突变H2B R102会增强酵母端粒和HML沉默交配位点的沉默，并增加Sir4与这些区域的结合。H2B R102A突变株还抑制酵母端粒附近内源性基因的表达，这可能是由于Sir复合体在该突变株中的异位扩散所致。我们提出了一个结构模型，通过该模型H2B R102和K111调节Sir复合物与核小体的结合。

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图1。
图1。
哺乳动物细胞中经翻译后修饰的组蛋白H2B核心折叠结构域中保守残基的鉴定。（A） 组蛋白H2B序列的比对。核心折叠域中的翻译后修饰残基呈彩色。酵母组蛋白H2B中不保守或位于N端和C端结构域的修饰未被描述。（B） 核心可修饰组蛋白H2B残基在酵母核小体结构中的位置。指出组蛋白H2B核心折叠域中翻译后修饰的保守位点。组蛋白H2B残基被描绘成水卡通；其他组蛋白残基显示为白色卡通。结构数据（PDB代码1id3；网址：www.rcsb.org)来自参考。使用POLYVIEW（41）绘制图像。
图2。
图2。
组蛋白H2B核心残基的突变使酵母细胞对DNA损伤剂敏感。（A） 组蛋白H2B丙氨酸突变菌株在DNA损伤剂MMS存在下的生长表型。每个菌株的十倍系列稀释液（从大约5×10开始5细胞）在含有指定浓度MMS的SC-Trp培养基或SC-Trp-培养基上发现。（B） 检测组蛋白H2B核心突变株在0、50和100 J/m剂量下对紫外线照射的敏感性2。将每个菌株中活细胞的百分比绘制为紫外线剂量的函数。仅描述了具有显著紫外线敏感性表型的组蛋白H2B丙氨酸突变株。WT，野生型。
图3。
图3。
组蛋白H2B核心突变体对端粒和HML公司沉默。（A） 十倍系列稀释液（从大约5×10开始5如图所示，在SC-Trp、SC-Trp-Ura或SC-Trp+5-FOA琼脂平板上发现每个组蛋白H2B丙氨酸突变株的细胞。（B） 组蛋白H2B突变株中端粒沉默表型的量化。每个数据点代表三个重复实验的平均值。误差线表示标准偏差，以及表现出显著敏感性的应变(P（P）<0.05）与野生型不同，用星号表示。（C和D）赖氨酸到精氨酸、赖氨酸-谷氨酰胺和精氨酸到赖氨酸H2B突变体的沉默表型。按照面板A和B所述进行斑点和定量分析。（E）组蛋白H2B核心突变体对端粒沉默的影响阿德2报告基因。组蛋白H2B突变体被连续稀释并在SC-Trp板上生长3天，然后在4°C下再放置3天。然后将每个菌落的颜色分类为白色、深粉红色或浅粉红色/扇形。所示数据是以存活菌落总数的百分比表示的每个菌落颜色，并表示三个独立样本的平均值。误差条代表标准偏差，与野生型显著不同的突变用“a”表示(P（P）<0.05）或“b”(P（P）<0.01）。（F和G）组蛋白H2B核心突变体对细胞内沉默的影响HML公司基因座。野生型（WT）或组蛋白H2B突变体的十倍稀释HML公司在SC-Trp或SC-Trp-Ura琼脂平板上发现沉默测试菌株。组蛋白H2B突变株的沉默表型通过遵循先前公布的方法进行量化（22）。每个数据点代表五个重复实验的平均值，误差条表示标准偏差。表现显著的菌株(P（P）<0.05）与野生型不同的敏感性用星号表示。
图4。
图4。
组蛋白H2B R102和K111突变体影响Sir4与酵母端粒的结合HML公司基因座。ChIP分析用于确定Sir4蛋白与端粒V-L（Chr V-L）（A）和端粒VI-R（Chr VI-R）（B）的结合水平。对野生型（WT）和组蛋白H2B突变株进行ChIP分析。使用未标记菌株（UT）作为对照。Sir4结合率标准化为行动1或SPS2系列使用输入DNA的内部控制，如前所述（21）。误差条表示三个独立样本的标准偏差。每组具有统计差异的样本(P（P）<0.05）由数据（a、b、c或d）上方的单独字母表示。（C和D）组蛋白H2B R102A突变增强了SIR4公司-依赖方式。对H2B R102AΔ进行端粒沉默试验和定量分析sir4双突变体，如图3A至D所示。将结果与组蛋白H2B R102A和Δ的结果进行比较sir4个体突变体。星号表示样本在统计上与野生型不同(P（P）< 0.05). （E） 组蛋白H2B R102和K111的突变影响Sir4与酵母的结合HML公司基因座。ChIP测定用于测定在HML-E公司消音器区域。以未标记菌株作为对照，对野生型和组蛋白H2B突变菌株进行ChIP分析。Sir4结合比率标准化为行动1免疫沉淀DNA样本中的内部控制。误差条表示三个独立样本的标准偏差，星号表示显著的样本(P（P）<0.05）不同于野生型。
图5：。
图5：。
（A） 组蛋白H2B R102A突变抑制端粒近端基因的表达。描述了组蛋白H2B R102A突变相对于野生型的全基因组表达变化的染色体图。mRNA水平上调或下调的基因部分的直方图绘制为它们与染色体末端距离的函数。（B） 组蛋白H2B R102A突变导致Sir4扩散到端粒以外。采用ChIP分析检测野生型和组蛋白H2B R102A和K111A突变株中Sir4蛋白与端粒V-L五个区域的结合水平。使用未标记的菌株作为对照，Sir4结合率标准化为动作1使用输入DNA，如前所述（21）。误差条表示三个独立样本的标准偏差。（C） 组蛋白H2B核心突变不会改变组蛋白H2B蛋白的稳定性或其并入染色质。使用前面描述的细胞分离方案（23）制备野生型（WT）组蛋白H2B和R102A、K111A和R102A/K111A突变体的染色质提取物，并通过Western blotting进行检测。组蛋白突变株的组蛋白H2B蛋白水平与野生型相比没有显著变化。组蛋白H3用作负荷对照。α、 反。
图6。
图6。
组蛋白H2B R102A/K111A双突变体对端粒沉默和Sir4结合的影响。（A和B）端粒沉默分析如图3所示。将H2B R102A/K111A双突变体的结果与H2B R102 A和H2B K111A单突变体的效果进行比较（图3）。星号表示明显的应变(P（P）<0.05）不同于野生型（WT）。（C） 对Sir4与端粒V-L和VI-R端粒区域结合的ChIP分析。如图4A和B所示，进行ChIP分析(P（P）<0.05）由数据（a、b、c或d）上方的单独字母表示。
图7。
图7。
潜在组蛋白H2B翻译后修饰位点的蛋白质印迹分析。（A） 定制抗体设计用于检测酵母组蛋白H2B K111的二甲基化或乙酰化。肽点杂交证实，每个抗体对修饰肽的特异性高于未修饰肽，并且抗H2B K111ac抗体不与赖氨酸4二甲基化的组蛋白H3肽发生非特异性结合。（B） 定制抗H2B K111me2和抗H2B K111Ac抗体不能特异性检测酵母组蛋白H2B的修饰。使用抗H2B K111me2、抗H2B K111Ac或抗H2B抗体通过Western blotting检测野生型和组蛋白H2B K111突变酵母菌株全细胞提取物。（C） 从野生型酵母细胞中纯化组蛋白，并使用H2B K111me2抗体通过Western blotting进行分析。（D） 人类组蛋白H2B K46被乙酰化和二甲基化。使用抗-H2B K46Ac和抗H2B K46me2抗体来确认MCF7乳腺癌细胞提取物中人类组蛋白H2B（hH2B）K46的两种修饰。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂曲古抑菌素A（TSA）或丙戊酸（VPA）的治疗导致组蛋白H2B K46乙酰化增加。重组组蛋白H2B（rH2B）上未检测到乙酰化或二甲基化。
图8。
图8。
（A和B）组蛋白H2B R102（蓝色）和H2B K111（红色）残基在酵母核小体晶体结构中的位置（1id3[50]）。使用POLYVIEW（41）绘制图像。组蛋白H2B R102和K111与核小体结合Sir3相互作用的（C到F）模型。MacPyMOL公司(http://www.pymol.org)基于已发表的Sir3与酵母核小体对接模型（35），使用生成显示组蛋白H2B R102和K111与Sir3相互作用的图像。DNA呈品红色，组蛋白残基呈青色，Sir3蛋白呈绿色。LRS结构域以黄色突出显示，组蛋白H2B R102以深蓝色显示，组分子H2B K111以红色显示，Sir3 R210以橙色突出显示。面板D至F是放大或旋转的Sir3-H2B相互作用图像，如面板C所示，DNA隐藏在视线之外。（G） Sir3和Orc1 BAH结构域蛋白序列的序列比对酿酒酵母,反常酵母菌,巴亚努斯酵母菌、和芽殖酵母。使用带有默认参数的CLUSTALW执行多序列比对。兽类和半兽类抑制突变体的位置用紫色星号突出显示（参考文献35中的数据）。Sir3 R210残留物以橙色突出显示，并用橙色星号标记。
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