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.2010年6月；120(6):2194-205.
doi:10.1172/JCI41722。 Epub 2010年5月3日。

组织型纤溶酶原激活剂是小鼠海马区的神经保护剂

拉米罗·埃切弗里 1, 吴嘉陵, 沃尔代布·B·海尔, 约翰娜·古兹曼, 曼努埃尔·耶佩斯
附属公司

组织型纤溶酶原激活剂是小鼠海马区的神经保护剂

拉米罗·埃切弗里等。 临床研究杂志. 2010年6月.

摘要

丝氨酸蛋白酶组织型纤溶酶原激活物（tPA）最著名的功能是作为溶栓酶。然而，在极易受到低氧诱导的细胞死亡影响的大脑结构中也发现了这种蛋白，而这种蛋白与神经元存活的关系尚不清楚。在这里，我们已经证明，缺乏tPA活性的小鼠大脑海马区更容易在缺血损伤后发生神经元死亡。我们发现，亚致死性缺氧（在一种称为缺血预处理（IPC）的自然过程中引发对随后致命性缺氧/缺血损伤的耐受）诱导了神经元tPA的快速释放。用tPA诱导海马神经元对致命缺氧损伤的耐受性治疗，在损伤后立即应用（早期IPC）或24小时后应用（延迟IPC）。tPA诱导的早期IPC独立于tPA的蛋白水解活性，需要LDL受体家族的一个成员参与。相反，tPA诱导的延迟IPC需要tPA的蛋白水解活性，并由纤溶酶、NMDA受体和PKB磷酸化介导。我们还发现，体内IPC增加了野生型小鼠（而非tPA或纤溶酶原缺乏小鼠）的菊芋角1区（CA1）层tPA活性和海马Akt磷酸化，以及缺血耐受性。这些数据表明，tPA可以在小鼠海马区发挥内源性神经保护剂的作用。

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数字

图1
图1。tPA活性与海马细胞死亡的关系。
(A类–L（左）)常温下WT小鼠背海马甲酚紫染色和原位酶谱分析的代表性图片(A类–D类)或WT和tPA缺乏(t驻车辅助系统–/–)小鼠服用BCCAO 20分钟后72小时(E类–L（左）). 注意WT（CA1层，G公司)和t驻车辅助系统–/–小鼠（CA1-CA2和CA3层；我,K（K）、和L（左）). 原始放大倍数，×4(A类,B类,E类,F类,我、和J)和×20(C类,D类,G公司,H（H）,K（K）、和L（左）). (M（M）–X（X）)常温下WT小鼠CA1层DAPI、Fluoro-Jade和TUNEL染色的代表性图片(M（M）–P（P）)或WT和t驻车辅助系统–/–小鼠服用BCCAO 20分钟后5天(问–X（X）). 注意在两个WT中都存在广泛的坏死变化、神经变性和凋亡细胞死亡(问–T型)和t驻车辅助系统–/–老鼠(U型–X（X）). 蓝色是DAPI，绿色是Fluoro-Jade(N个,R（右）、和五)或TUNEL(P（P）,T型、和X（X）). 原始放大倍数，×40(M（M）–X（X）).
图2
图2。缺氧对神经元死亡的时间依赖性影响。
海马(A类–C类)和皮层神经元(D类–F类)在0、15、30和60分钟期间暴露于OGD条件，然后通过荧光测定法（LIVE/DEAD活力测定；A类和D类)或台盼蓝染色(C类和F类)用MTT法测定细胞存活率(B类和E类). 中的值A类,C类,D类、和F类以死亡细胞相对于每个场的细胞总数的百分比给出。中的值B类和E类与正常氧条件下维持的神经元细胞存活率相比，以百分比表示。误差条表示SD*P（P）与OGD下维持0–30分钟的细胞相比，<0.05。n个=每个实验6–12个观察结果。
图3
图3。tPA对神经元存活的影响。
(A类和D类)海马介质中酶活性tPA的平均增加(A类)和皮质(D类)神经元暴露于OGD条件下0-60分钟。误差条表示SD。n个= 12. *P（P）与常压下维持的对照组相比，<0.05。插图是每条曲线前5分钟的放大图。(B类和E类)海马细胞存活率的平均降低(B类)和皮层神经元(E类)在常氧条件下用0–1μM tPA培养24小时后。误差条表示SD。n个= 10. *P（P）与未经处理的细胞相比，<0.05（白色条）。(C类和F类)WT（白条）和tPA缺陷患者的细胞存活率平均下降(t驻车辅助系统–/–; 黑条）海马(C类)和皮质(F类)神经元暴露于OGD条件下55分钟或保持在常氧条件下（无OGD）。用1μM tPA（+tPA）孵育一组神经元。误差条表示SD。n个=每次观察10。在C类: *P（P）与常氧条件下保存的细胞相比，<0.05**P（P）与无tPA的OGD条件下维持的神经元相比，<0.05。在F类: *P（P）与在无tPA的OGD条件下维持的WT细胞或WT和t驻车辅助系统–/–OGD条件下维持神经元并用tPA处理**P（P）与WT和t驻车辅助系统–/–在无tPA的OGD条件下维持神经元。
图4
图4。tPA诱导的早期预处理。
(A类)用tPA（nM）或itPA处理海马神经元后暴露于OGD条件55分钟内的平均细胞存活率。n个=每次观察20。误差条表示SD*P（P）与未处理细胞相比<0.05**P（P）与未经处理的神经元和接受500 nM tPA处理的细胞相比，<0.05。(B类和C类)暴露于OGD条件（55分钟）并单独或与α2-抗纤溶酶（AP，140 nM）或RAP（100 nM），或与NMDAR拮抗剂MK-801（10μM）或DL-AP5（50μM）之一，或与纤溶酶单独作用（Pl；100 nM，或与RAP单独作用。n个=20英寸B类和n个=15英寸C类误差条表示SD。InB类: *P（P）与未经处理的细胞相比，<0.05**P（P）与OGD条件下保存的细胞相比，<0.05***P（P）与OGD条件下维持的神经元和单独使用tPA的神经元相比，<0.05。在C类: *P（P）与OGD条件下保存的细胞相比，<0.05，且未经处理或仅与MK-801或DL-AP5孵育。(D类)与250μM KA单独或与1μM tPA联合孵育后的平均神经元存活率*P（P）与未处理细胞相比，<0.05。n个= 10. 误差条表示所有面板中的SD。“PREC”（预处理）表示细胞与每种化合物孵育的时刻。
图5
图5。tPA诱导的延迟预处理。
(A类–C类)60 nM tPA或1μM itPA治疗24小时后暴露于OGD条件下（55分钟）海马神经元的平均存活率(A类); 或结合60 nM tPA和140 nMα2-抗凝血酶、1.4μM抑肽酶（Apro）、20 mM EACA、100 nM RAP、10μM MK-801或50μM DL-AP5；或单独使用200 nM纤溶酶原（Plg）或单独使用100 nM纤溶酶或单独使用RAP(B类和C类). 在A类: *P（P）与常压条件下的细胞相比，<0.05**P（P）与OGD条件下未处理的神经元和itPA处理的细胞相比，<0.05。在B类和C类: *P（P）与OGD条件下未处理细胞相比，<0.05**P（P）与未处理的细胞相比，<0.05***P（P）与单独用tPA或纤溶酶处理的细胞相比，<0.05。n个=20（每观察一次）A类和B类和n个=15英寸C类误差条表示SD(D类)Western blot分析检测用60 nM tPA或100 nM纤溶酶孵育的海马神经元中NMDAR NR2A亚单位的表达。(E类)单独用250μM KA孵育后或用60nM tPA处理后24小时的平均神经元存活率*P（P）与未处理细胞相比<0.05**P（P）与KA处理的细胞相比，<0.05。n个= 10. 误差条表示所有面板中的SD。
图6
图6。Akt磷酸化介导tPA诱导的延迟耐受。
(A类)用60 nM tPA、60 nM itPA或tPA与10μM MK-801的组合孵育60分钟的WT海马神经元裂解液中Akt磷酸化丝氨酸473（pAkt）、总Akt（tAkt。(B类)在OGD条件下暴露55分钟时，单独或联合tPA与20 nM沃特曼蛋白孵育的海马神经元的平均MTT降低。n个= 10. 误差条表示SD*P（P）与其他实验组相比，<0.05。(C类)用60 nM tPA、100 nM纤溶酶或20 nM沃特曼或tPA与沃特曼联合或沃特曼与纤溶酶孵育的海马神经元平均MTT降低，24小时后暴露于OGD条件下55分钟。n个= 12. 线表示SD*P（P）与沃特曼和tPA联合治疗的神经元相比，<0.05**P（P）与沃特曼和纤溶酶联合治疗的神经元相比，<0.05。“PREC”表示与每种化合物孵育的时刻。MTT，通过MTT分析量化细胞存活。
图7
图7。内源性tPA诱导延迟缺氧预适应。
(A类)WT和t驻车辅助系统–/–神经元在亚致死OGD条件下预处理30分钟，24小时后暴露于致死OGD（55分钟）。n个= 12–15. *P（P）与正常氧条件下维持的WT神经元相比，<0.05**P（P）与未修复神经元相比，<0.05***P（P）与相比<0.05t驻车辅助系统–/–细胞维持在常氧状态。(B类)140 nMα存在下亚致死性OGD预处理WT神经元的平均神经元存活率2-抗凝血酶、1.4μM抑肽酶、20 mM EACA、10μM MK-801、20 nM沃特曼（麦芽）或100 nM RAP。n个= 6–10. *P（P）与非预处理细胞相比，<0.05**P（P）与所有预处理细胞相比，<0.05。(C类)平均神经元存活率t驻车辅助系统–/–在存在60nM tPA或tPA和10μM MK-801、tPA和20nM wortmannin或tPA和100nM RAP的组合的情况下，用亚致死性OGD预处理的神经元，随后24小时发生致命的缺氧损伤（OGD 55分钟）。误差条表示SD。n个= 8–10. *P（P）与未处理的预处理细胞相比，<0.05**P（P）与在tPA存在下预处理的细胞相比，<0.05。
图8
图8。IPC增加海马CA1层tPA活性和纤溶酶原表达。
(A类)预处理期间海马区脑灌注变化的典型示例，3次BCCAO持续1分钟，每次间隔5分钟正常灌注。(B类和C类)WT和t驻车辅助系统–/–小鼠在3次BCCAO后立即按照A类注意海马CA1层中存在tPA活性（B类). (D类和E类)WT海马CA1层甲酚紫染色(D类)和t驻车辅助系统–/–(E类)小鼠在3次间歇性BCCAO发作后48小时。注意，尽管与WT小鼠相同海马区的tPA活性显著增加，但没有出现细胞死亡。(F类和G公司)前WT小鼠CA1层纤溶酶原的免疫反应性(F类)以及之后(G公司)工控机。蓝色是DAPI，绿色是纤溶酶原。原始放大倍数，×4(B类和C类)和×40(D类–G公司).
图9
图9。tPA缺乏对延迟IPC体内模型的影响。
(A类–F类). WT背海马甲酚紫染色的代表性图像，t驻车辅助系统–/–、和Plg公司–/–按照方法中的描述，在不使用（–IPC）和使用（+IPC）IPC的BCCAO 20分钟后72小时，小鼠提前24小时进行试验。原始放大倍数，×20。(G公司)WT海马损伤平均得分，t驻车辅助系统–/–、和Plg公司–/–小鼠服用BCCAO 20分钟后72小时，不服用（-）或提前24小时服用（+）IPC。n个=8–10个观察值*P（P）与预处理的WT小鼠相比，<0.05。(H（H）)WT中丝氨酸473磷酸化的Akt（pAkt）的代表性蛋白质印迹分析，t驻车辅助系统–/–、和Plg公司–/–IPC后0、1、6和24小时的小鼠表现如图8所示。泳道是在同一种凝胶上运行的，但并不相邻。
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参考文献

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