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.2010年11月；17(11):1707-16.
doi:10.1038/cdd.2010.42。 Epub 2010年4月30日。

幽门螺杆菌VacA诱导细胞凋亡过程中内体-线粒体并列

F卡洛尔 1, C天才集, 卡塞利亚托, M Rossato先生, G科多洛, M D Esposti先生, L斯科拉诺, 德伯纳德
附属公司

幽门螺杆菌VacA诱导细胞凋亡过程中内体-线粒体并列

F卡洛尔等。 细胞死亡差异. 2010年11月.

摘要

空泡化细胞毒素（VacA）是幽门螺杆菌的重要毒力因子，对哺乳动物细胞具有多效性作用，包括触发线粒体依赖性凋亡的能力。然而，VacA发挥其凋亡功能的机制尚不清楚。在这项研究中，我们使用遗传学方法表明，VacA的杀伤需要线粒体水平的促凋亡Bcl-2家族成员BAX和BAK，但不需要足够的内质网Ca²（+）水平，类似地由BAX和BAK控制。亚细胞分馏和成像的结合表明，野生型VacA（而非其通道形成区域的突变体）诱导BAX在内胚体上的积累，并在线粒体上活性BAX恢复之前诱导内胚体-线粒体并置。值得注意的是，在BAX和Bak缺乏的细胞中，VacA不能引起内体-线粒体并置，也不能在线粒体中回收。因此，VacA在细胞死亡过程的早期导致内体和线粒体的BAX/BAK依赖性并置，揭示了这些促凋亡蛋白在调节细胞器相对位置中的新功能。

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数字

图1
图1
VacA诱导的细胞死亡需要促凋亡蛋白BAX和BAK。(一)Wt MEF细胞与幽门螺杆菌CS，wt或P9A突变。在6、18、24、48和72小时后，按照制造商的说明进行Annexin-V分析。细胞荧光法测定Annexin-V-Alexa 568-阴性细胞的存活率。(b条)如上所述，培养Bax/Bak DKO MEF细胞并分析其活性。细胞未暴露于幽门螺杆菌CS定义为未经处理的细胞。数据表示平均值±S。20个独立实验的D。使用Student’st吨-CS-中毒细胞与未处理细胞的配对数据检验***P<0.01
图2
图2
VacA在DKO中诱导空泡化，但在wt MEF中不诱导。Wt和DKO MEFs与幽门螺杆菌重量CS。5小时后，用中性红摄取试验测定空泡化程度。结果表示为540 nm和405 nm处获得的OD值之间的差值，为平均值±S。三个独立实验的D
图3
图3
VacA诱导的细胞死亡涉及线粒体凋亡通路。对DKO MEF细胞进行基因和选择性纠正：通过将BAX专门靶向线粒体来纠正线粒体缺陷(一)SERCA过度表达导致ER缺陷(b条). 如图1所示，对细胞进行培养和活性分析。细胞未暴露于幽门螺杆菌CS定义为未经处理的细胞。数据表示平均值±S。20个独立实验的D。使用Student’st吨-CS-中毒细胞配对数据检验与未处理细胞**P（P）<0.02; ***P（P）<0.01
图4
图4
VacA触发BAX活化并将其转移到线粒体(一)wt MEF细胞经24小时孵育后的典型共焦图像幽门螺杆菌CS，wt或P9A突变。用兔抗VacA抗体和二级FITC抗兔抗体对细胞进行免疫染色。BAX是用对其活化形式（克隆6A7）特异的鼠单克隆一级抗体和二级TRITC抗鼠抗体检测的。这些图像代表了五个独立实验中检测的60个细胞。比例尺：10μm.VacA和活化BAX共定位的曼德系数为0.21±0.0231（wt）幽门螺杆菌CS-中毒细胞与P9A突变CS-处理细胞中0.09±0.00198的比较(n个=5个独立实验，每个实验60个细胞）。(b条)从与wt或P9A突变株孵育的wt MEF细胞中纯化线粒体幽门螺杆菌指定时间点的上清液；15μ用SDS-PAGE和免疫印迹法分离线粒体蛋白g；用兔抗BAX抗体显示BAX。使用抗COX II单克隆抗体作为等负荷对照。细胞未暴露于幽门螺杆菌CS定义为未经处理的细胞
图5
图5
EEA1、LAMP1和TOM20在从wt MEF细胞纯化的内体和线粒体组分中的分布。如前所述分离早期内体（EE）、晚期内体（LE）和线粒体，15μ用SDS-PAGE分离g蛋白质，并用所示抗体进行免疫印迹
图6
图6
VacA靶向线粒体(一)Wt MEF细胞与Wt或P9A突变体孵育24小时幽门螺杆菌上清液，如所述进行收获和亚分级。十五或五十μ用SDS-PAGE分离g早期内体（EE）、晚期内体（LE）和线粒体（Mt）蛋白，并用所示抗体进行免疫印迹。(b条)用编码mtRFP的质粒转染的Wt-MEF细胞与Wt或P9A突变体一起孵育幽门螺杆菌反恐精英。培养24小时后，固定细胞，用兔抗VacA抗体和二级FITC抗兔抗体对毒素进行染色。这些图像代表了从三个单独的实验中检测到的60个细胞。比例尺，10μ米(c（c）)平均值±S。D.（n=3，每个独立实验20个细胞）共定位数据b条使用Student’st吨-小波变换的配对数据检验幽门螺杆菌CS治疗与P9A治疗幽门螺杆菌CS-处理细胞***P（P）< 0.01
图7
图7
VacA诱导内膜和线粒体膜的共同分离。Wt或DKO MEF细胞与幽门螺杆菌CS，wt或P9A突变体；在指定的时间点进行亚细胞分离，15μ用SDS-PAGE和免疫印迹法分离早期内体（EE）、晚期内体（LE）和线粒体（Mt）蛋白g；特异性抗体显示VacA、BAX、EEA1和LAMP1。细胞未暴露于幽门螺杆菌CS定义为未经处理的细胞
图8
图8
(一)VacA G14A不会诱导线粒体的内体劫持。线粒体是用幽门螺杆菌CS（wt或G14A突变型）。使用SDS-PAGE，15μ然后分离g蛋白，并用多克隆抗EEA1、抗LAMP1和抗BAX抗体探测膜。COX II被用作线粒体等负荷的标记(b条)COX II在从醉酒的wt MEF纯化的内体和线粒体组分中的分布。总共15个μg从未经处理的wt MEF细胞中纯化的早期内体（EE）、晚期内体（LE）和线粒体（Mt）蛋白，用wt处理幽门螺杆菌将CS或带有突变P9A的CS装入SDS-PAGE并进行免疫印迹。COX II在线粒体中的专属定位允许在亚细胞分馏过程中排除线粒体碎片对内体的任何污染
图9
图9
在VacA中毒的细胞中，早期和晚期内体靠近线粒体。Wt MEF细胞与幽门螺杆菌CS，wt或P9A突变体，在被处理用于免疫荧光之前。（左面板）抗Rab5（绿色染色）和抗TOM20（红色染色）抗体分别用于标记早期内体膜和线粒体膜。（右面板）抗LBPA（绿色染色）用于标记晚期内膜。比例尺，10μ含有放大细节的m.正方形显示了暴露于wt毒素的细胞内体和线粒体标记之间的明显共定位。细胞未暴露于幽门螺杆菌CS定义为未经处理的细胞。所有这些图像代表了从三个单独的实验中检测到的每种条件下的60个细胞。平均值±S。D(n个=3，每次实验20个细胞）。使用Student’st吨-对暴露于326 P9A的wt CS-中毒细胞与未处理细胞/细胞的配对数据进行测试***P（P）<0.01
图10
图10
在VacA中毒的细胞中，内膜与线粒体共分馏。将Wt MEF细胞与幽门螺杆菌CS，wt或P9A突变体，在进行免疫电子显微镜处理之前。(一)用抗LBPA抗体分别标记P9A突变体（左面板）和wt-CS（右面板）暴露细胞的晚期内体膜。N、 细胞核；箭头指向线粒体；金颗粒识别晚期内体。比例尺对应于0.84μm（左侧面板）至0.47μm表示右侧面板。(b条)MEF的形态计量学分析一线粒体数量在5.25以内μ从内体表面计算m（未处理细胞为22.37±1.1，326个P9A处理细胞为46.74±2.33，326 wt处理细胞为90.63±4.53）。数字是指线粒体总面积为65μ米2围绕内体。(c（c）)MEF细胞的形态计量学分析一测量晚期内体所占的总细胞面积（每种情况下平均考虑12个内体）
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