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.2010年4月5日4:14。
doi:10.3389/fnbeh.2010.00014。 2010年电子收藏。

脑特异性神经锌指转录因子2b（NZF-2b/7ZFMyt1）抑制大鼠可卡因自行给药

维贾伊·钱德拉塞卡 1, Jean-Luc Dreyer公司
附属公司

大脑特异性神经锌指转录因子2b（NZF-2b/7ZFMyt1）抑制大鼠的可卡因自我给药

维杰·钱德拉塞卡等。 前行为神经科学. .

摘要

慢性可卡因暴露后，中缘多巴胺能区诱导了大脑特异性神经锌指转录因子-2b（NZF2b/7ZFMyt1），伏隔核中慢病毒介导的NZF2b/7ZFMet1表达导致运动活性降低（Chandrasekar和Dreyer，2010）。本研究观察了NZF2b/7ZFMyt1在活性可卡因寻找中的作用及其与组蛋白去乙酰化酶的相互作用。NZF2b/7ZFMyt1在伏隔核的局部表达导致可卡因自我给药减弱，而用表达siRNAs的慢病毒沉默该转录因子增加了动物自我注入可卡因的动机。低剂量的丁酸钠（组蛋白去乙酰化酶的一种有效抑制剂）足以逆转NZF2b/7ZFMyt1介导的可卡因自我给药减少。NZF2b/7ZFMyt1的表达导致转录因子REST1和NAC1以及多巴胺D2受体的强烈诱导，伴随着BDNF及其受体TrkB的抑制。我们发现NZF2b/7ZFMyt1与组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）共定位，可能克服了Lingo1对转录活性的抑制。这些发现表明，由NZF2b/7ZFMyt1表达介导的分子适应可能导致对可卡因增强特性的反应性降低，并在影响药物诱导的行为改变中发挥显著作用。

关键词：成瘾；可卡因；转录因子。

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数字

图1
图1
NZF-2b/7ZFMyt1在伏隔核（NAc）的差异表达改变可卡因的自我给药使用注射了可调节LV-7ZFMyt1、LV-GFP和非可调节LV.7ZFMyt1-siRNAs的动物。手术、恢复和训练后，大鼠(n个 = 7） 自己服用可卡因（1 小时/天）。会话A：喂食动物时不使用强力霉素6次 天；会议B：然后在饮用水中给动物喂食多西环素6天 天；会议C：最后将动物换回来，在不使用强力霉素的情况下再次喂食（见材料和方法）。会话A：NZF-2b/7ZFMyt1在NAc中的异位表达抑制可卡因自我给药，而NZF-2-b/7ZVMyt1的局部敲除促进自我融合。会议B：强力霉素介导的异位NZF-2b/7ZFMyt1表达抑制（黑条）导致可卡因自我给药抑制的逆转（将疗程A与疗程B进行比较，黑条），自我灌注与对照LV-GFP水平相当。会议C：脱去强力霉素会逆转A疗程中观察到的最初行为。数据显示三个疗程中可卡因自我注入的平均值±SEM*P（P） < 0.05时**P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001，表示数值与Lenti-7ZFMyt1组有显著差异；+P（P） < 0.05,++P（P） < 0.01和+++P（P） < 0.001表示数值与Lenti-GFP组、双向方差分析、Bonferroni组显著不同事后（post-hoc）测验。
图2
图2
HDAC抑制剂丁酸钠（NaB）逆转NZF-2b/7ZFMyt1介导的自我给药抑制.结束时会议C（图1），喂食不含强力霉素的动物给予NaB（100 毫克/千克，静脉注射）30 连续三天在每次可卡因自我给药测试前min。数值代表三个LV治疗组可卡因自我注入的平均值±SEM(n个 = 7). NaB治疗将NAc中7ZFMyt1过度表达时观察到的可卡因自我给药抑制恢复到与对照LV-GFP组相当的水平。LV-GFP组和LV-7ZFMyt1-siRNA组在NaB治疗后均未出现任何统计上显著的变化*P（P） < 0.05时**P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001，表示相同组在C期（无NaB）和D期（有NaB）、双向方差分析、Bonferroni事后（post-hoc）测验。
图3
图3
自给可卡因后NZF-2b/7ZFMyt1在NAc中的表达.（A）在行为研究（可卡因自我给药）结束后，从喂食或不喂食强力霉素的动物中提取NAc样本。通过qRT-PCR相对亲环素测定NZF-2b/7ZFMyt1 mRNA的表达水平。与LV-GFP对照组相比，LV-7ZFMyt1组的NZF-2b/7ZFMyt1-siRNA表达增加，而在LV-7ZVMyt1-siRNA组中，与LV-GFF组相比，NZF-2-b/7ZVMyt1表达显著降低。抑制异位表达的多西环素方案导致LV-7ZFMyt1组中NZF-2b/7ZFMytl水平显著降低*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01***P（P） < 0.001代表与LV-GFP组显著不同的值，并且+P（P） < 0.05;++P（P） < 0.01;+++P（P） < 通过双向方差分析，0.001表示与LV-7ZFMyt1组显著不同的值，Bonferroni事后（post-hoc）测验。（B）自给可卡因后LV处理动物NAc中NZF-2b/7ZFMyt1蛋白水平的Western blot分析（见材料和方法）。含有20种凝胶的蛋白质印迹 用NZF-2b/7ZFMyt1抗体分析μg蛋白/车道。与GFP对照组相比，LV-7ZFMyt1组显示出高蛋白表达，而LV-7ZVMyt1-siRNA组在NZF-2b/7ZFMyt1mRNA水平上表现出强烈抑制，与观察到的mRNA水平相关。用抗β-肌动蛋白抗体重制膜，作为标准蛋白对照。与mRNA表达谱一样，多西环素抑制异位NZF-2b/7ZFMyt1表达水平至对照GFP组。
图4
图4
慢病毒介导的NZF-2b/7ZFMyt1的表达在NAc的神经元细胞核中募集并与HDAC2共定位在存在或不存在多西环素的情况下，在可卡因自我给药行为测试结束时处死动物。对大脑进行解剖并进行免疫化学处理（见材料和方法）。（比例尺：20 微米）。（A）抗Myt1抗体双重免疫染色（红色）和Hoechst细胞核染色（蓝色）（100倍放大）；合并图像显示，NZF-2b/7ZFMyt1表达定位于NAc的大多数细胞核（如果不是全部的话）。（B）用抗Myt1抗体进行双重免疫染色，检测NZF-2b/7ZFMyt1蛋白（绿色）和抗NeuN（神经元细胞核标记物；红色）（100倍放大）；合并图像显示，NZF-2b/7ZFMyt1主要与细胞核内的NeuN共存（黄色）。（C）用抗Myt1（绿色）和抗TH（酪氨酸羟化酶；红色）抗体进行双重免疫染色（63倍放大）；合并图像显示，NZF-2b/7ZFMyt1的大部分表达定位于NAc的TH-免疫活性投射区（黄色）。（D）用抗Myt1（红色）、Hoechst（细胞核染色；蓝色）和抗Oligo2（少突胶质细胞标记物；绿色）抗体进行三联染色（放大63倍）。尽管Hoechst（蓝色）对所有细胞核进行非特异性染色，无论细胞类型如何，寡突胶质细胞标记物Oligo2与Myt1相比表现出不同的特征。合并后的图像显示，只有少数单元格（箭头）在NAc中显示Oligo2和NZF-2b/7ZFMyt1（黄色）的共定位。（E）在多西环素存在（红色）或不存在（绿色）的情况下，NAc针道内用抗Myc标记的异位NZF-2b/7ZFMyt1低分子量（20倍），显示异位表达的严格调节，Myc公司-标记为NZF-2b/7ZFMyt1。（F）用抗Myt1（绿色）和抗HDAC2（红色）抗体进行三重免疫染色（63倍放大）；合并后的图像显示NZF-2b/7ZFMyt1与HDAC2在神经元细胞核中的共同定位。（G）用抗Myt1（红色）、Hoechst（细胞核染色；蓝色）和抗Lingo1（Nogo-receptor复合物成分；绿色）抗体进行三联染色（63倍放大）。Lingo1仅限于细胞质，而NZF-2b/7ZFMyt1定位于神经元的细胞核，如Hoechst细胞核染色（蓝色）所示。
图5
图5
NAc中的NZF-2b/7ZFMyt1特异性改变了几个奖励相关基因的表达.qRT-PCR定量：NAC1（A）; 休息1（B）; 多巴胺受体DAD2R（C）; BDNF及其受体TrkB（D），α-突触核蛋白和四spanin CD81（E）对大鼠NAc组织进行qRT-PCR(n个 = 7） 用LV-7ZFMyt1或LV-7ZVMyt1-siRNAs或LV-GFP双侧注入NAc（见材料和方法）。计算与亲环素相关的表达水平。NZF-2b/7ZFMyt1的异位表达导致NAC1的表达增加（A）休息1（B），DAD2R（C）BDNF和TrkB表达减少（D）而它并没有显著改变α-突触核蛋白和四spanin CD81的表达（E）NZF-2b/7ZFMyt1具有结合域的其他基因很少（数据未显示）。抑制异位NZF-2b/7ZFMyt1表达的多西环素方案导致NAC-1显著降低（A）休息区1（B）和DAD2R（C）级别*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01***P（P） < 0.001表示与注射lent-GFP的大鼠显著不同的值，并且+P（P） < 0.05;++P（P） < 0.01;+++P（P） < 通过双向方差分析（Bonferroni），0.001代表与LV-7ZFMyt1注射大鼠显著不同的数值事后（post-hoc）测验。
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