An excitatory loop with astrocytes contributes to drive neurons to seizure threshold

doi:10.1371/journal.pbio.1000352

.2010年4月13日；8（4）：e1000352。

doi:10.1371/journal.pbio.1000352。

星形胶质细胞的兴奋环有助于将神经元驱动至癫痫阈值

马尔塔·戈梅斯·冈萨洛¹, 加布里埃尔·洛西, 安吉拉·奇瓦瓦加托, 米凯拉·佐塔, 马里奥·卡马罗塔, 马可·布朗迪, 弗朗西斯科·维特里, 劳拉·乌瓦, Tullio披萨, 马可·德·柯蒂斯, 吉安·米歇尔·拉托, 乔治·卡米尼奥托

附属公司

PMID： 20405049
预防性维修识别码：项目经理2854117
内政部： 10.1371/期刊.生物.1000352

星形胶质细胞的兴奋环有助于将神经元驱动到癫痫阈值

马尔塔·戈梅斯·冈萨洛等。公共科学图书馆生物. 2010.

.2010年4月13日；8（4）：e1000352。

doi:10.1371/journal.pbio.1000352。

作者

附属

¹意大利帕多瓦帕多瓦大学神经科学研究所（CNR）。

PMID： 20405049
预防性维修识别码：项目经理2854117
内政部： 10.1371/日志.pbio.1000352

摘要

局灶性癫痫的发作是由高度同步的神经元放电维持的，这种放电产生于局限的大脑部位，随后扩散到大脑的大部分。尽管在这一领域进行了大量的实验研究，但早期引发和维持局灶性癫痫发作的细胞事件仍不明确。他们的鉴定对于理解局灶性癫痫的病理生理学和开发抗药性癫痫的新药物治疗方法至关重要。最近提出星形胶质细胞参与黄疸发生。我们在这里测试星形胶质细胞和神经元之间的合作是否是支持发作性（癫痫样）和发作间期癫痫样事件的先决条件。在大鼠内嗅皮层薄片局部应用N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导的局灶性癫痫新体外模型中，同时进行斑贴灯记录和Ca2+成像技术。我们发现星形胶质细胞中Ca2+的升高与局灶性癫痫样放电的初始发展和维持有关。在其他模型（包括整个体外分离的豚鼠脑）中也观察到癫痫放电期间星形胶质细胞的延迟激活其中无法精确监测癫痫发作活动的发生地点。相反，发作间期放电与星形胶质细胞中的Ca2+变化无关。选择性抑制或刺激星形胶质细胞Ca2+信号分别阻断或增强发作性放电，但不影响发作间期放电的产生。我们的数据显示，神经元与星形胶质细胞在一个反复的兴奋回路中结合（可能涉及神经传递），从而促进癫痫发作的点燃并维持癫痫发作的放电。这种神经-星形胶质细胞相互作用可能是开发有效治疗策略以控制癫痫发作的新靶点。

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提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。大多数星形胶质细胞以钙反应²⁺上升到发作期，但不是发作间期。**
（A）钙²⁺相对于基础水平的变化(t吨 ₀)，在发作间期的神经元（n，黑色箭头）和星形胶质细胞（a，白色箭头）中(t吨 ₁)或是一次发作(t吨 ₂)用苦毒毒素/零毫克进行EC切片灌注后的事件²⁺。比例尺代表20µm。（B） AP爆发和Ca²⁺补丁神经元的变化（绿色痕迹）和Ca²⁺其他神经元和星形胶质细胞的变化如（A）所示。注意大Ca²⁺ictal诱发星形胶质细胞升高(t吨 ₂)而不是间歇(t吨 ₁)事件。（C） 2P-LSM钙²⁺豚鼠EC成像前(t吨 ₀)在开发过程中(t吨 ₁和t吨 ₂)荷包牡丹碱动脉灌注引起的发作性放电。比例尺表示20µm。（D）场电位和Ca²⁺发作性放电期间神经核（[C]中的虚线圆圈）和星形胶质细胞（[C]内的箭头）的信号变化。（E）发作间期和发作性激活星形胶质细胞的平均百分比。每个条形图上的数字表示所检查的星形胶质细胞总数。所分析的发作间期和发作期事件在大鼠CA3中分别为130和21，在大鼠EC中分别为69和15，在豚鼠EC中分别为347和31。该图和其他图中的误差条表示SEM。

**图2。星形胶质细胞钙²⁺信号抑制不影响发作间期放电。**
（A–D）EC切片制备中不同实验条件下，发作放电激活的星形胶质细胞平均百分比（A）、发作放电的平均持续时间（B）和频率（C）以及发作间期放电的平均频率（D）。控件(n个 = 16）、MPEP(n个 = 7），PPADS公司(n个 = 9）和MPEP+PPADS(n个 = 3). 单个星号（*）表示第页<0.05; 双星号（**），第页<0.01.

**图3。星形胶质细胞中PAR-1受体的激活有利于产生发作性放电。**
（A）显示PAR-1（红色）和GFAP（绿色）免疫反应的图像以及EC层V-VI的合并图像；86.7%的GFAP阳性星形胶质细胞为PAR-1免疫阳性。比例尺表示20µm。（B）高倍共聚焦图像显示EC第V-VI层PAR-1和GFAP免疫反应的融合图像。注意PAR-1点状信号的连续性，这些信号可能与GFAP阳性星形胶质细胞突起的GFAP阴性远端部分（白色箭头）有关。比例尺表示5µm。（C）条形图显示，在D-AP5和TTX存在的情况下，用TFLLR（10µM）进行浴灌未能触发任何Ca²⁺从三个不同的实验中分析了70个神经元的反应。（D）钙²⁺在TTX存在下应用单个TFLLR脉冲（由一个开放的红色箭头指示）后，星形胶质细胞升高（顶部轨迹）和相邻神经元的全细胞记录（下部轨迹）。Ca公司²⁺星形胶质细胞升高后，邻近补丁神经元中的SIC激活。请注意，相对于自发发生的快速突触微型事件（*），SIC（插图）的动力学较慢。（E）报告TFLLR脉冲前后SIC频率的条形图。绝大多数SICs（11个中有6个）发生在TFLLR诱发的Ca的10秒内²⁺星形胶质细胞增多。TFLLR诱导Ca后未观察到SIC²⁺D-AP5存在时星形胶质细胞升高。（F）苦曲霉毒素/零毫克²⁺模型中，用TFLLR（开放的红色箭头）刺激星形胶质细胞足以引起发作性放电。

**图4。局部神经元激活引起发作性放电。**
（A）钙的绘制和假彩色图像²⁺基础条件下的信号(t吨 ₀)显示V层神经元上含有NMDA的移液管和贴片移液管的EC切片。比例尺表示20µm。（B）伪彩色(t吨 ₁)和差异图像(t吨 ₁−t吨 ₀)本地Ca的²⁺单个NMDA脉冲后发生变化。（C） Ca的伪彩色和差异图像²⁺由双NMDA脉冲触发的响应。t吨 ₂和t吨 ₂−t吨 ₀说明初始Ca²⁺靠近NMDA移液管区域（A区，黄色虚线）的神经元和周围B区的一些神经元的升高。t吨 ₃和t吨 ₃−t吨 ₀说明Ca²⁺反映发作性放电的所有神经元的变化₁)NMDA诱导补丁神经元和Ca的AP放电²⁺在单个NMDA脉冲（由黑色箭头指示）后，此（绿色轨迹）和场A和场B的其他神经元发生变化。（D）₂)打补丁神经元的AP爆发（另见插图）和Ca²⁺在由双NMDA脉冲（黑色箭头）诱导的发作放电期间，该神经元和来自A场和B场的其他神经元的变化。垂直虚线表示从直接反应开始（左线）到B区神经元出现发作性放电的过渡阶段（右线）。t吨 _0-3标记（A–C）中所示图像的计时*图5中也报告了痕迹。（E） TTX能阻断A区和B区神经元的发作性放电，但不能阻断A区神经元对双NMDA脉冲（黑色箭头）的直接反应。

**图5。发作性放电的产生伴随着钙²⁺星形胶质细胞升高。**
（A）钙²⁺图4A-4D所示的相同实验中，a区神经元、B区神经元和a区和B区星形胶质细胞的变化。单个NMDA脉冲不能激活星形胶质细胞（红色和蓝色痕迹，左），而双NMDA脉冲则引起大的星形胶质细胞Ca²⁺A区（红色迹线，右）的上升与发作性放电的初始发展有关，而B区（蓝色迹线，右图）的上升紧随其后。垂直虚线表示过渡阶段*图4中的痕迹用于比较。（B）高倍图像（左面板中的虚线框）显示了早期Ca²⁺A区星形胶质细胞在过渡期增加(t吨 ₁)和Ca晚期²⁺发作性放电后B区星形胶质细胞数量增加(t吨 ₂). 箭头和箭头分别标记神经元和星形胶质细胞。比例尺表示20µm。（C）显示早期或晚期Ca的A区星形胶质细胞（13个实验，262个反应性星形胶质细胞）和B区星形细胞（12个实验，187个反应性胶质细胞）的百分比²⁺增加。（D）左图显示了两个含有NMDA的移液管（NMDA 1和NMDA 2）的位置以及两个NMDA脉冲激活的重叠区域。对，加州²⁺A1场神经元、A2场神经元以及重叠区域中的神经元和星形胶质细胞对一个或两个移液管施加的单个NMDA脉冲的反应发生变化。同时应用于两个移液管的单个NMDA脉冲可引起大的星形胶质细胞Ca²⁺重叠区域的上升和发作放电。

**图6。MPEP/PPADS抑制A区星形胶质细胞可损害发作性放电的产生。**
（A）钙²⁺来自a区神经元、B区神经元和a区星形胶质细胞的信号，以响应NMDA刺激的重复发作（黑色箭头）。通过MPEP和PPADS浴灌阻断星形胶质细胞反应后，引发发作性放电的NMDA刺激无效。增加NMDA烟团（白色箭头）的数量可以恢复发作性放电。双NMDA脉冲诱发星形胶质细胞活化和抑制剂冲洗后的发作放电。（B）顶部，A区和B区的图纸，说明了不同的实验条件。三个黑色箭头表示局部放电的扩散。红色斑点表示局部MPEP/PPADS应用的区域。底部，Ca²⁺来自场a神经元、场B神经元、场a星形胶质细胞和场B星形胶质细胞的信号，以响应NMDA刺激的重复发作（黑色箭头）。在A区局部应用MPEP/PPADS后，诱发发作性放电的双NMDA脉冲无效，但在B区无效。另请注意，在A区应用MPEP/PPADS后，没有出现“早期”反应性星形胶质细胞，而在B区应用MPEP/PPADS后，“晚期”反应性星状胶质细胞只有轻微变化。

**图7。选择性抑制星形胶质细胞会损害发作性放电的产生。**
（A）在EC切片中用含有德克萨斯红的移液管修补单个星形细胞后，德克萨斯红标记的星形细胞合胞体的最大投影。顶部条形图，报告标记的星形胶质细胞合胞体的平均大小(n个 = 5）和NMDA直接激活的神经元区域(n个 = 4). 比例尺表示20µm。（B） EC切片上显示Ca的图像²⁺休息时BAPTA在星形细胞合胞体扩散前后A区神经元和星形细胞中的信号(t吨 ₀和t吨 ₂）和NMDA刺激后(t吨 ₁和t吨 ₃）。反应神经元（黑色箭头）和星形胶质细胞（白色箭头）显示。注意BAPTA后没有星形胶质细胞反应(t吨 ₃). 比例尺表示20µm。（C）钙²⁺（B）所示的一些神经元和星形胶质细胞的变化。还报告了Ca²⁺图像中不存在的B区神经元发作性放电的变化（灰色痕迹）。抑制星形胶质细胞Ca后，可引起发作性放电的NMDA刺激无效²⁺BAPTA在字段A中发出信号（红色记录道）。（D）早期反应区A星形胶质细胞数量和钙振幅的变化²⁺在BAPTA抑制或未能抑制发作性放电的实验中，BAPTA在星形胶质细胞合胞体内扩散后施加双NMDA脉冲激活的增加，以对照值的百分比表示，即在BAPTA透析前t吨-测试，星号（*）表示第页<0.05. （E）反应神经元的数量和Ca的振幅²⁺BAPTA在星形胶质细胞合胞体扩散过程中TTX存在下重复双NMDA脉冲后的信号(n个 = 3），表示为与BAPTA传播前进行的测量相关的相对值。（F） EC切片的差分干涉对比图，显示含有BAPTA的移液管（箭头）和用于触发首次发作性放电的NMDA移液管的第一个位置（区域1中的星号）。然后将NMDA移管移至区域2，其尖端由两个星号表示。虚线圆圈表示每个区域中的字段A。小圆圈标记区域1（神经元1）和区域2（神经元2）中B场神经元的位置。比例尺代表100µm。（G） BAPTA在星形胶质细胞合胞体扩散50分钟后，双NMDA脉冲诱导1区A、B区神经元发作性放电及其失败。（H）将NMDA移液管移到区域2后，双NMDA脉冲诱发的发作性放电恢复。（I）钙²⁺A、B区神经元和A区星形胶质细胞的变化说明BAPTA在不同EC切片中抑制发作性放电，并在将NMDA刺激增加到三个脉冲（白色箭头）后恢复。注意，增加NMDA刺激后，星形胶质细胞的激活部分恢复，但反应延迟，并在B区神经元出现发作性放电后发展。

**图8。选择性星形胶质细胞激活有利于局灶性发作放电。**
在4-AP模型中，只有当星形胶质细胞Ca²⁺增加是由TFLLR引起的。

**图9。发作性放电产生中的神经元-星形胶质细胞环。**
周期性神经元-星形胶质细胞兴奋回路中的事件序列示意图，该回路在受限的大脑部位形成，从而导致癫痫发作。N个₁和N₂神经-星形胶质细胞信号；A类₁和A₂，星形胶质细胞对神经元的信号传递。

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