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.2010年6月；24(6):1136-50.
doi:10.1210/me.2009-0466。 Epub 2010年4月6日。

糖原合成酶激酶-3在介导糖皮质激素诱导的细胞凋亡中起核心作用

雷切尔·斯波科尼 1, 什洛米特·科菲尔·埃尔恩菲尔德, 艾坦·叶芬诺夫, 罗尼特·沃格特·西奥诺夫
附属公司

糖原合成酶激酶-3在介导糖皮质激素诱导的细胞凋亡中起核心作用

雷切尔·斯波科尼等。 分子内分泌学. 2010年6月.

摘要

目前尚不清楚糖皮质激素（GC）是如何诱导胸腺细胞和T淋巴瘤细胞凋亡的。抗GC淋巴瘤细胞的出现是GC治疗的主要障碍，强调需要新的策略来保持淋巴瘤细胞对GC促凋亡作用的敏感性。我们进行了一项激肽组研究，以阐明参与介导GC诱导凋亡的信号转导途径。我们的研究表明，糖原合成酶激酶（GSK3）在促进GC诱导的凋亡中起着核心作用。在缺乏配体的情况下，GSK3alpha（而非GSK3beta）被隔离到糖皮质激素受体（GR）。暴露于GC导致GSK3alpha与GR分离，随后GSK3alpha和GSK3beta与促凋亡Bim蛋白相互作用，Bim蛋白是GC诱导凋亡的重要介质。通过SB216763、BIO-Acetoxime或LiCl对GSK3进行化学抑制，并使用GSK3的显性阴性突变体抑制GSK3，从而阻止该细胞死亡过程，表明GSK3参与了凋亡信号的传递。通过抑制磷脂酰肌醇-3激酶-Akt生存途径，使GSK3失活，可以减轻淋巴瘤细胞对GC的耐药性。Notch1是T急性淋巴细胞白血病细胞中经常激活的一种转录因子，通过激活Akt赋予GC耐药性。总之，本研究阐明了上游GR信号与GC诱导凋亡的下游介质之间的联系。我们的数据表明，靶向参与GSK3失活的蛋白激酶可以改善GC治疗的结果。

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数字

图1。
图1。
蛋白激酶抑制剂对GC诱导的细胞凋亡的影响。在不存在或存在各种蛋白激酶抑制剂的情况下，将胸腺细胞（A）、PD1.6 T淋巴瘤（B）、S49 T淋巴瘤（C）和CCRF-CEM T ALL（D）细胞与指定浓度的Dex一起孵育20小时（A-C）、48小时（C和D）或72小时（D）。细胞凋亡通过PI-exclusion分析测定，这是评估淋巴瘤和白血病细胞死亡的最充分的方法（32）。PI-排除试验的结果与caspase-3激活试验相关。Src抑制剂PP1；p38抑制剂SB203580；甲乙酮抑制剂PD98059；JNK抑制剂SP600125；Cdk2抑制剂roscovitine；SB216763，一种GSK3抑制剂。酪蛋白激酶I（CKI）抑制剂从Calbiochem获得，酪蛋白激酶II（CKII）抑制剂为4,5,6,7-四溴苯并三唑。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.005; ***,P（P）< 0.0005. 控制。
图1。
图1。
蛋白激酶抑制剂对GC诱导的细胞凋亡的影响。胸腺细胞（A）、PD1.6 T淋巴瘤（B）、S49 T淋巴瘤（C）和CCRF-CEM T ALL（D）细胞在没有或存在各种蛋白激酶抑制剂的情况下与指定浓度的Dex孵育20 h（A–C）、48 h（C和D）或72 h（D）。细胞凋亡通过PI-exclusion分析测定，这是评估淋巴瘤和白血病细胞死亡的最充分的方法（32）。PI-排除试验的结果与caspase-3激活试验相关。Src抑制剂PP1；p38抑制剂SB203580；甲乙酮抑制剂PD98059；SP600125，一种JNK抑制剂；Cdk2抑制剂roscovitine；SB216763，GSK3抑制剂。酪蛋白激酶I（CKI）抑制剂从Calbiochem获得，酪蛋白激酶II（CKII）抑制剂为4,5,6,7-四溴苯并三唑。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.005; ***,P（P）< 0.0005. 控制。
图2。
图2。
抑制GSK3可阻止Dex诱导的细胞凋亡。A–E，特异性GSK3抑制剂SB216763可防止Dex诱导的T淋巴瘤细胞和胸腺细胞凋亡。高GC敏感性PD1.6 T淋巴瘤（A）、2B4 T杂交瘤（B）和胸腺细胞（C），以及部分耐药的B10（D）和S49（E）T淋巴瘤细胞，在Dex存在或不存在的情况下，用不同浓度的GSK3抑制剂SB216763治疗20小时（A–C）或48小时（D和E）。细胞凋亡通过PI-exclusion分析测定。F、 表达GSK3激酶活性变体（PD1.6GSK3βR85）的PD1.6对Dex诱导的凋亡产生抵抗。用不同浓度的Dex处理细胞20小时，并通过PI排除测定细胞凋亡。P（P）< 0.001.
图3。
图3。
GSK3α与GR.A相互作用，Dex处理对GSK3磷酸化的影响。PD1.6细胞未经处理或用100 n米Dex用于指示的时间间隔，并使用磷酸化-Ser9 GSK3β、磷酸化Tyr216 GSK3α、GSK3γ或α-Tubulin抗体进行Western blotting（WB）处理。B、 GSK3α与天然GR相互作用，并在Dex治疗后释放。胸腺细胞未经处理或用100 n米指示时间间隔的Dex。使用GR（Santa Cruz Biotechnology）和蛋白A珠特异性M20抗体对总裂解物进行免疫沉淀（IP）。一步Genscript IP-WB试剂盒用于Western blot分析，以防止检测到重链。然而，如图所示，可以看到一条重链。应用GSK3α/β（0011-α，Santa Cruz Biotechnology）抗体。对于IP分析，运行两个IP前样本（通道1和9；输入1:40的IP样本）以显示GSK3α和-β的位置。通道2只包含抗体（Ab），它提供了重链的位置。在免疫沉淀（Pre-IP）前采集总裂解物样品，以显示指示蛋白的初始表达水平。C、 GR与PD1.6 T淋巴瘤细胞中的GSK3α相互作用。PD1.6细胞未经处理（第1道），或用SB216763和/或Dex处理1小时。按照面板B所述进行免疫沉淀。面板a和面板B是两种不同的暴露。GSK3α带出现在重链带的正上方。D、 GSK3α与GR的选择性结合。用5μg编码hGRα（1–3道）、hGSK3β（2和4道）和/或hGSK3-β的质粒转染MCF-7细胞.HA（血凝素标记）（车道3和5）。样本1、4和5中包含空的pcDNA3载体（5μg），以获得等量的转染DNA。用抗GR的M20抗体免疫沉淀细胞裂解物，并用WB分析共免疫沉淀GSK3的存在，如图B.E所述。长期抑制GSK3导致GR表达降低。用SB216763处理PD1.6细胞2小时和24小时，并通过蛋白质印迹分析GR表达水平。β-连环蛋白表达表明GSK3受到抑制。
图4。
图4。
胸腺细胞（A）和2B4 T细胞（B）暴露于Dex后，GSK3α和GSK3β与Bim相互作用。胸腺细胞（A）和2B4 T细胞（B）未经处理或用100 n米指示时间间隔的Dex。用Bim抗体免疫沉淀细胞裂解物，并使用非还原蛋白样品缓冲液进行蛋白质印迹分析。如图3B所示，通过Western blotting检测协同免疫沉淀的GSK3α和GSK3β。
图5。
图5。
通过减轻Akt介导的GSK3抑制来克服S49细胞的GC抗性。A、 部分耐药的S49 T淋巴瘤细胞显示Akt激活增强，抗凋亡Bcl-2和细胞内裂解Notch1（ICN）水平升高。对高度GC敏感性PD1.6 T淋巴瘤、过度表达ICN-Notch1（PD1.6Notch1）的PD1.6细胞以及部分耐药的B10和S49 T淋巴瘤细胞进行了Western blot分析。c组中使用的抗体对磷酸化-Ser9 GSK3β具有特异性。它还在S49细胞中检测到一个较慢的迁移带，可能是磷酸化的Ser21-GSK3α。B和C，沃特曼（B）或Akt抑制剂VIII（C）对PI3K-Akt轴的抑制使S49细胞具有GC敏感性。S49细胞用100 n米在测量细胞凋亡程度之前，单独使用地塞米松或在沃特曼（C）或Akt抑制剂VIII（D）浓度增加的情况下放置20小时。两种药物单独使用对S49细胞均无凋亡作用，而联合治疗可诱导强烈的凋亡。D、 PI3K抑制剂沃特曼抑制Akt和GSK3磷酸化。S49细胞未经处理或用沃特曼和/或Dex处理1 h。用phospho-Ser473 Akt、phospho-Ser21/9 GSK3α/β、GSK3β或α-微管蛋白抗体进行Western blot分析。E和F，GSK3抑制剂SB216763（E）和BIO-乙酰肟（F）可防止沃特曼对地塞米松过敏。S49细胞暴露于5μ米沃特曼，5μ米SB216763或0.5–1μ米BIO-丙酮肟，含或不含100 n米检测细胞凋亡前20 h的Dex。G、 Bim的shRNA可防止S49细胞对Dex诱导的凋亡的沃特曼敏化。对照组S49细胞或转染pSilencer-Bim的S49细胞暴露于5μ米沃特曼和/或100 n米Dex，20小时后测量凋亡程度。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001.
图6。
图6。
Notch1通过激活Akt并随后抑制GSK3而赋予GC抗性。A和B，ICN-Notch1的过度表达使2B4细胞产生GC抗性，但对PD1.6细胞没有。将过度表达ICN-Notch1（A）、PD1.6（B）或PD1.6的2B4（A），2B4Notch1细胞暴露于Dex 20 h。通过PI排除法测量细胞凋亡。C、 ICN-Notch1在2B4细胞中具有转录活性，但在PD1.6细胞中不具有转录活性。对指示的细胞系进行RT-PCR分析，以检测GR、SRG3（一种与GC敏感性相关的基因产物（86））和Notch调节的基因Deltex1的mRNA。家政基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为对照。D、 2B4Notch1细胞显示Akt磷酸化升高。未经处理或Dex处理（100 n）的蛋白质印迹分析米，2 h）2B4和2B4Notch1电池。E、 Mcl-1在过度表达Notch1的2B4细胞中诱导产生。通过Western blotting分析所示细胞系的总提取物。
图7。
图7。
GC诱导胸腺细胞和T淋巴瘤细胞凋亡的拟议模型。该模型基于本研究中描述的结果，并结合文献中公布的数据。在缺乏配体的情况下，GR被隔离在与Hsps和免疫亲和素（1号）结合的胞浆中。GR的一部分也与GSK3α相互作用。接触GC后，GR从热休克复合物中释放，GSK3α从GR（2号）中分离。GR二聚并转位到细胞核和线粒体（3号）。细胞核易位发生在敏感和耐药T淋巴瘤细胞中，而线粒体易位仅发生在敏感细胞中（参考文献13）。在细胞核中，GR通过反式激活和反式阻遏改变多个基因的转录（编号4）。重要的是，必需的促凋亡Bim上调，这一过程需要适当激活p38和转录因子FoxO3（参考文献35）。Bim经常在许多造血细胞中高基础水平表达（参考文献1）。GR易位到线粒体传递信号（5号），可能激活GSK3（6号）。GSK3α和GSK3β与Bim（编号7）相互作用。Bim作用于Bax和Bak（编号7）的上游，后者执行凋亡级联（编号8）（参考文献87）。GSK3β还可磷酸化VDAC（编号7），导致己糖激酶II从线粒体分离，并促进Bax与线粒体的结合（参考文献65）。因此，GC诱导的细胞凋亡受到核GR之间的协同作用的影响(例如Bim上调）、线粒体GR（发送非基因组信号）和GSK3（激活固有凋亡途径的下游效应器）。活化蛋白1；NFκB，核因子-κB。
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