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.2010年4月21日；29(8):1401-11.
doi:10.1038/emboj.210.37。 Epub 2010年3月18日。

UTX在肌肉发生过程中介导肌肉特异性基因H3K27me3去甲基化

沙耶斯塔·西恩顿 1, 什拉文蒂·兰帕利, 刘启才, 阿里夫·阿齐兹, 卡门·巴利, 孙华红, 亚历山大·布莱斯, Marjorie品牌, Kai Ge公司, 弗朗西斯·杰弗里·迪尔沃思
附属公司

UTX在肌肉发生过程中介导肌肉特异性基因H3K27me3去甲基化

沙耶斯塔·西恩顿等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

Polycomb（PcG）和Trithorise（TrxG）组蛋白相互拮抗，建立组织特异性基因表达模式。PcG蛋白Ezh2通过催化组蛋白H3-Lys27三甲基化（H3K27me3）促进抑制。对于表达，去除H3K27me3标记，并用TrxG蛋白催化组蛋白H3-Lys4三甲基化（H3K4me3）取代。虽然已经鉴定出H3K27脱甲基酶，但这些酶针对特定基因组区域去除H3K27me3标记的机制尚未确定。在这里，我们证明了肌发生过程中UTX介导的肌肉特异性基因去甲基化的两步机制。虽然反式激活子Six4最初将UTX招募到肌肉基因的调控区域，但H3K27me3标记的丢失仅限于转录起始点的上游区域。去除编码区内抑制性H3K27me3标记需要RNA聚合酶II（Pol II）伸长。有趣的是，阻断Pol II在转录基因上的延伸导致编码区内H3K27me3增加，并形成二价（H3K17me3/H3K4me3）染色质结构域。因此，UTX去除抑制性H3K27me3标记是通过靶向招募然后在基因中传播来实现的。

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数字

图1
图1
肌肉分化期间组蛋白H3在Myog和CKm基因上的甲基化。(A类)Myog和CKm基因的示意图。P代表基因启动子，而CKm基因中的E代表增强子（远端和内含子）元件。示意图上方的圆圈数字表示基因上的位置，每个不同的探针组在这里定位以分析ChIP研究。(B,C类)通过Myog和CKm基因对H3K27me3或H3K4me3富集的时间（0、24和48小时）变化进行本地ChIP分析。使用抗H3K27me3或抗H3K4me3抗体对从分化不同阶段的C2C12细胞中分离的染色质进行免疫纯化。脱蛋白后，使用识别图1A示意图中所示不同区域的探针，通过qPCR对免疫纯化DNA进行定量。
图2
图2
在C2C12肌发生过程中，UTX与Myogenin和CKm基因座相关。(A类)使用针对UTX、Ezh2或Ash2L的抗体对C2C12细胞（生长（0 h）或分化（24或48 h））的交叉染色质进行ChIP分析。使用识别Myog启动子（左侧）或CKm基因远端增强子（右侧）的探针，通过qPCR对免疫纯化DNA进行定量。为了说明三种不同抗体的IP效率的可变性，在首次计算绝对富集度作为输入染色质的百分比后，将相对富集度绘制为在48小时时间过程中单独观察到的每个因子的最大富集值的百分比。(B)Myog和CKm基因UTX富集的时间（0、24和48小时）变化的X-ChIP分析。使用抗UTX抗体对从分化不同阶段的C2C12细胞中分离的染色质进行免疫纯化。脱蛋白后，使用识别图1A示意图中所示不同区域的探针，通过qPCR对免疫纯化DNA进行定量。
图3
图3
UTX介导肌发生过程中Myog和CKm基因H3K27me3标记的去除。(A类)分化C2C12细胞中UTX敲除的Western blot分析。用SDS-PAGE分离由感染慢病毒的细胞制备的核提取物，该慢病毒表达靶向UTX或对照（加扰）的shRNA，并用所示抗体进行western blot分析。每个面板表示由于空间限制而裁剪的同一凝胶上的两条车道。未截取的斑点如补充图7所示。(B)UTX敲除后C2C12细胞中的基因表达。使用Myog、CKm或普遍表达的DDX5 mRNA的特异性引物扩增C2C12细胞在生长（−）或分化（+）条件下制备的cDNA。如图所示，细胞被非靶向干扰shRNA（对照）或UTX靶向shRNA感染。(C类)将用对照（扰乱）或UTX靶向shRNA感染的C2C12细胞分化72小时，然后通过免疫细胞化学检测肌动蛋白（鬼笔肽染色）、Myog或MHC，而DNA用DAPI染色。图像是在蔡司510共焦显微镜上使用40个透镜生成的。(D类)原生ChIP分析测量了Myog、CKm或HoxB8基因座内不同区域的相对H3K27me3水平。用靶向shRNA的对照细胞（shRNA-scrambled）或UTX细胞（shRNA-UTX）感染C2C12细胞，用嘌呤霉素选择感染，然后分化72小时。基因座上的位置对应于图1A示意图中所示的区域。
图4
图4
Six4将UTX靶向肌肉特异性基因。(A类)使用针对UTX、Myog、Six4或对照IgG的抗体从C2C12核提取物（24小时分化）中免疫沉淀蛋白质。免疫沉淀蛋白和输入的1/50，使用所示抗体通过western blot进行检测。左侧面板对应于免疫沉淀实验，其中输入和洗脱样品一起处理。剪切印迹以去除对应于流通部分的通道，因此输入部分与洗脱部分用白条分开，但在相同的凝胶上运行，具有相同的暴露。UTX和Six 4分析的未删节版本如补充图6A所示。(B)使用针对Six4、Mef2或对照IgG的抗体，从红白血病细胞系K562的核提取物中免疫沉淀蛋白质。免疫沉淀蛋白和输入的1/10用所示抗体进行western blot检测。星号(*)标记从K562细胞中的UTX抗体观察到的非特异性条带。Mef2/IgG表明在K562细胞中观察到的两条Mef2带与IgG共同迁移。为了提供证据证明在Mef2-IP通道中观察到的较强条带代表免疫沉淀的Mef2，我们在补充图6B中提供了一个较短的印迹曝光时间，其中缓慢迁移的Mef2条带可与IgG区分开来。注意，由于样品在含有尿素的缓冲液中洗脱，因此本实验中的所有洗脱带迁移率略高于输入中的对应物。(C类)来自C2C12细胞（生长（0 h）或分化（24 h））的交叉链接染色质接受Six4结合的ChIP分析。使用识别Myog（区域3）、CKm（区域2）或IgH的水解探针，通过qPCR定量免疫纯化DNA。(D类)Western blot分析从感染慢病毒的细胞中分离的蛋白提取物，该慢病毒表达靶向Six4或干扰对照的shRNA。用SDS-PAGE分离由感染慢病毒的细胞制备的核提取物，该慢病毒表达靶向UTX或对照（加扰）的shRNA，并用所示抗体进行western blot分析。每个面板代表在同一凝胶上运行的两条车道，由于空间限制，这些车道已被裁剪。未修剪的斑点如补充图8所示。(E类)从感染了表达Six4靶向（或对照）shRNA的慢病毒的细胞中分离的RNA被逆转录并进行qPCR分析。表达水平是相对于DDX5表达的。(F类)使用针对UTX的抗体对生长（−）或24小时分化（+）C2C12细胞的交叉染色质进行ChIP分析。使用识别Myog启动子（区域3）或CKm上游增强子（区域2）的探针，通过qPCR定量免疫纯化DNA。(G公司)使用针对H3K27me3的抗体对生长（−）或24小时分化（+）C2C12细胞的天然染色质进行ChIP分析。使用识别Myog基因启动子（区域3）或CKm上游增强子（区域2）的探针，通过qPCR对免疫纯化DNA进行定量。
图5
图5
Myog和CKm基因的UTX招募是p38 MAPK独立的。(A类)使用识别Ash2L或UTX的抗体对生长（分化−）或48小时分化（分化+）C2C12细胞的交叉染色质进行ChIP分析，这些细胞经过或不经过p38 MAPK（SB203580）药物抑制剂的处理。(B)在p38 MAPK抑制剂SB203580存在（+）或不存在（-）的情况下，对诱导分化48小时的C2C12细胞进行天然ChIP分析。H3K4me3（顶面板）或H3K27me3（底面板）ChIP通过qPCR使用Myog或CKm基因座上特定位置的探针进行分析，如图1A所示。
图6
图6
Pol II在活性转录基因上的诱导失速建立了双价染色质结构域。(A类)C2C12分化期间添加DRB的时间表。阴影框中的箭头提供了肌生成过程中Myog和CKm基因表达的大致时间。(B)如图所示，用DRB处理分化的C2C12细胞。从C2C12细胞中制备随机扩增cDNA，并使用Taqman引物/探针集进行qPCR（顶面板），该引物/探头集使用Myog、UTX或18S rRNA特异引物扩增CKm或18S r RNA或半定量PCR（下面板）(C类)使用针对Pol II（Rpb1）的抗体对C2C12细胞（生长（0 h），−DRB）的交叉染色质进行ChIP分析，或在有DRB（48 h，+DRB）或无DRB（48h，−DR）的情况下分化48 h。使用识别图1A示意图中所示区域的水解探针，通过qPCR对免疫纯化DNA进行定量。(D类)在生长（0 h）或分化（48 h）条件下，从C2C12细胞中分离出染色质，并用100μM DRB处理，如图6A中的时间表所示。(E类)对从分化的C2C12细胞（48 h）中分离出来的染色质进行天然re-ChIP分析，这些细胞在存在（+DRB）或不存在（−DRB）转录延伸抑制剂DRB的情况下孵育3 h。纯化用抗H3K4me3抗体免疫沉淀的染色质，并使用抗H3K27me3抗体重新免疫沉淀。使用识别IgH基因或Myog或CKm基因+1000区域（区域4）的水解探针，通过qPCR对免疫纯化DNA进行定量。
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