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.2010年5月1日；21(9):1556-68.
doi:10.1091/mbc.e09-12-1002。 Epub 2010年3月17日。

Yip1A构建哺乳动物内质网

凯特琳·戴克斯特拉 1, 杰奎琳·波库萨, 约瑟夫·苏汉, 蒂娜·H·李
附属公司

Yip1A构建哺乳动物内质网

凯特琳·戴克斯特拉等。 分子生物学细胞. .

摘要

内质网（ER）的结构在特殊细胞类型中经历高度调节的变化。经常观察到的一种变化是其重组为堆叠和同心螺纹膜，但其潜在机制和与货物出口的功能相关性尚不清楚。在这里，我们确定了Yip1A，一种在内质网和早期高尔基体之间循环的保守膜蛋白，作为内质网组织的关键介质。Yip1A耗尽导致网络重组为多个微米大小的同心螺纹。膜堆积和螺纹形成与外壳蛋白（COP）II介导的蛋白质输出显著减慢相一致。此外，由在COPII功能中没有作用的ER蛋白的外源性表达驱动的螺纹形成也延迟了货物出口。因此，由Yip1A缺失引起的蛋白质输出减慢可能归因于Yip1A在调节内质网扩散中的近端作用。Yip1A的内质网扩散功能被其N端细胞质结构域中一个保守氨基酸（E95K）的改变所阻断。这些结果揭示了一种保守的Yip1A介导的内质网膜组织机制，该机制可能用于调节货物从细胞器的出口。

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数字

图1。
图1。
RNAi介导的Yip1A缺失导致内质网致密化。（A） 免疫印迹显示两种不同的siRNAs丢失了Yip1A。稳定表达Golgi-localized GFP-GalNacT2的HeLa细胞转染对照siRNA、Yip1A siRNA-1或Yip1A siRNA-2；72小时后收获；并使用针对Yip1A、calnexin和tubulin的抗体进行检测。（B–G）Yip1A缺失与内质网形态变化相关。转染对照siRNA（B和C）、Yip1A siRNA-1（D和E）或Yip1A siRNA-2（F和G）的细胞72小时后固定，并用抗Yip1A（B、D和F）和PDI（C、E和G）抗体双重染色。棒材，10μm。（H） 内质网形态变化先于高尔基体碎裂。用对照siRNA或Yip1-siRNA-2转染的细胞在48或72小时后固定，并用PDI抗体染色。内质网和高尔基体形态按指示分类（高尔基体碎片，高尔基体碎裂；螺纹内质网表示内质网压实，如E和G所示；异常内质网表明内质网形态介于正常和螺纹之间）。显示了三个独立实验（>50个细胞/条件/实验）显示的内质网和高尔基形态的平均细胞百分比的定量，±SD。单星号表示p<0.05，双星号表示p<0.001（学生的t吨测试）。
图2。
图2。
缺乏Yip1A细胞的超微结构分析。（A和B）用对照（A）或Yip1A（B）siRNA处理的细胞的低倍薄片透射电镜图。箭头（B）表示只有在Yip1A siRNA处理细胞中才能看到致密的内质网膜聚集物。棒材，10μm。（C） 整个ER螺纹的高倍视图。条形，500 nm。（D） ER螺纹部分的叠层膜的高倍视图。条形，100 nm。（E和F）ER螺旋与核膜是连续的。两个相互连接的螺纹的低倍视图，每个螺纹都连接到核膜（E），以及一个螺纹的高倍视图，显示与外核膜（F）的连接。箭头（E和F）表示核膜，箭头（E、F）表示螺纹和核膜之间的膜连续性。N、 细胞核；C、 细胞质；W、 螺纹。巴，2μm（E）和100 nm（F）。
图3。
图3。
早期内质网螺纹由片和小管组成。（A–I）Yip1A siRNA处理48小时后，通过ER螺纹的连续（100-nm）透射EM薄片。条形，100 nm。（J） Yip1A siRNA处理48小时后，通过不同ER螺纹的薄片显微照片。箭头（i、ii和iii）表示管状形态的三个不同示例。穿过J螺纹相应区域（i、ii和iii）的系列100-nm薄片如i’、ii’和iii’所示。
图4。
图4。
螺纹ER表型由野生型而非突变型siRNA-免疫Yip1A构建物拯救。与Yip1A siRNA-2和对照Sec13-Myc构建物（a和B）、siRNA-免疫野生型FLAG-Yip1A构建物（C和D）或siRNA--免疫突变体（E95K）FLAG-Yip构建物（E和F）共转染的细胞在72小时后固定，并用针对Myc表位（a）和calnexin（B）或FLAG表位（C和E）的抗体双重染色和calnexin（D和F）。单个星号（A–F）表示表达ER轮的细胞。双星号（A–F）表示表达的细胞没有内质网螺旋。棒材，10μm。（G） 三个独立实验（每个实验>50个细胞）中Sec13-Myc或野生型或突变型（E95K）FLAG-Yip1A表达细胞显示轮生ER表型的百分比的定量，±SD。单个星号表示p<0.0001（学生t吨测试）。双星号表示无统计学显著差异。
图5。
图5。
野生型和E95K Yip1A都与DP1结合。（A） 将转染Myc-DP1或Myc-DP1L1的HeLa细胞溶解在1%Triton X-100中，并用对照抗体（IgG）或Yip1A抗体进行免疫沉淀。结合蛋白用针对Myc表位的抗体进行免疫印迹。（B） 用Myc-DP1和野生型FLAG-Yip1A或FLAG-Yip1A（E95K）共同转染的HeLa细胞溶解在1%Triton X-100中，并用M2 FLAG抗体珠进行免疫沉淀。结合蛋白用Myc表位抗体进行免疫印迹。作为对照，也显示了在没有FLAG-Yip1A的情况下在M2珠上恢复的Myc-DP1。
图6。
图6。
ER螺纹导致ts045 VSV-G从ER的出口速度减慢。（A–F）与Myc-ts045 VSV-G和对照siRNA（A–C）或Yip1A siRNA-2（D–F）共转染的细胞在转染后48 h转移到40°C以在内质网中积累VSV-G。额外24 h后，将细胞转移到32°C 0（A和D）、20（B和E）、60（C）或120（F）min以允许内质网输出。细胞被固定并用针对Myc表位和calnexin的抗体进行双重染色（仅显示Myc染色）。箭头（D–F）表示Calnexin染色标记的内质网螺旋的位置。棒材，10μm。（G） 定量表达Myc-ts045 VSV-G和ER后结构蛋白的细胞百分比。对于转染了Yip1A siRNA的细胞，仅对Calnexin染色标记的带有螺纹ER的细胞进行定量。所示为三个独立实验的平均值，±SD（使用学生的t吨测试）。
图7。
图7。
在缺乏Yip1A的细胞中，COPII招募并没有被阻止。（A–F）与Sec13-Myc和对照siRNA（A–C）或Yip1A siRNA-2（D–F）共转染的细胞在72小时后固定，并用针对Myc表位（A和D）和calnexin（B和E）的抗体进行双重染色。还显示了合并（C和F）。箭头（D–F）表示ER螺纹中缺少Sec13-Myc。棒材，10μm。（G–K）细胞溶胶依赖性COPII组装不需要Yip1A。第二次转染后72 H，用30μG/ml洋地黄素对双转染对照（G和H）或Yip1A siRNA-2（I和J）的细胞进行渗透，并用ATP再生系统和鸟苷5′孵育-O（运行）-（3-硫代）三磷酸，不含（G和I）或存在（H和J）4 mg/ml大鼠肝细胞液。37°C下20分钟后，细胞固定并用Sec13抗体染色。棒材，10μm。（K） 显示了在所示条件下Sec13-阳性结构中总荧光的定量，三个独立实验，±SD。
图8。
图8。
ER出口封锁不足以导致ER螺纹（A-E）。（A） Sar1击倒阻止ER导出。表达高尔基体标志物GFP-GalNacT2的HeLa细胞，转染以Sar1a和Sar1b亚型为靶点的对照siRNA或siRNAs，用2.5μg/ml BFA处理30分钟，将GFP-Gal NacT2-重新分配到内质网，然后在没有药物的情况下培养，以允许内质网输出。在指定的时间，固定细胞，并计算ER后结构中含有GFP-GalNacT2的细胞百分比。（B–E）Sar1敲除阻断ER出口不会影响ER形态。转染后72 h固定对照组（B和C）或Sar1敲除细胞（D和E），并用Sec13（B和D）和PDI（C和E）抗体进行双重染色。棒材，10μm。H89处理的（F–I）内质网出口封锁不影响内质网形态。将未处理的细胞（F和G）或用100μM H89（H和I）处理20分钟的细胞固定并单独染色以检测ERGIC-53（F和H）或PDI（G和I）。棒材，10μm。
图9。
图9。
ER膜堆叠足以减缓ER出口。将与Myc-ts045 VSV-G和对照mGFP-Sec61γ结构（未显示，但在M中量化）或内质网堆积诱导的dGFP-Sec62γ结构共同转染的细胞移至40°C，以在内质网中累积VSV-G。此后，将细胞移至32°C，持续0（a–C）、20（D–F）、60（G–I）或120（J–L）分钟，细胞固定并用Myc表位抗体染色。显示了相应的VSV-G（A、D、G和J）和GFP-Sec61γ（B、E、H和K）以及合并图像（C、F、I和L）。棒材，10μm。（M） 定量分析每种条件下VSV-G输出的动力学，显示两个独立实验的平均值±SD。
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    Barrabi C、Zhang K、Liu M、Chen X。 Barrabi C等人。 前内分泌（洛桑）。2023年4月21日；14:1155779. doi:10.3389/fendo.2023.115779。eCollection 2023年。 前内分泌（洛桑）。2023 PMID：37152949 免费PMC文章。 审查。
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    李Z、蔡S、孙毅、李力、丁S、王X。 Li Z等。 前免疫。2020年9月29日；11:2064. doi:10.3389/fimmu.2020.02064。eCollection 2020。 前免疫。2020 PMID：33133062 免费PMC文章。 审查。
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    1. Ahluwalia N.、Bergeron J.J.、Wada I.、Degen E.、Williams D.B.。p88分子伴侣与内质网膜蛋白calnexin相同。生物学杂志。化学。1992年；267:10914–10918.-公共医学
    1. Amarilio R.、Ramachandran S.、Sabanay H.、Lev S.通过VAP-Nir蛋白相互作用对内质网结构的差异调节。生物学杂志。化学。2005;280:5934–5944。-公共医学
    1. Anderson R.G.，Orci L.，Brown M.S.，Garcia-Segura L.M.，Goldstein J.L.UT-1细胞晶体内质网的超微结构分析及其在胆固醇作用下的消失。细胞科学杂志。1983;63:1–20.-公共医学
    1. Aridor M.、Balch W.E.激酶信号传导启动外壳复合物II（COPII）的募集和从哺乳动物内质网的输出。生物学杂志。化学。2000;275:35673–35676.-公共医学
    1. Barr F.A.、Puype M.、Vandekerckhove J.、Warren G.GRASP65，一种参与高尔基体池堆积的蛋白质。单元格。1997;91:253–262.-公共医学

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