JNK-mediated phosphorylation of Cdc25C regulates cell cycle entry and G(2)/M DNA damage checkpoint

doi:10.1074/jbc.M110.121848

.2010年5月7日；285(19):14217-28.

doi:10.1074/jbc。M110.121848。 Epub 2010年3月10日。

JNK介导的Cdc25C磷酸化调节细胞周期进入和G（2）/M DNA损伤检查点

古斯塔沃·J·古铁雷斯¹, Toshiya Tsuji先生, 珍妮特·克罗斯, 罗杰·戴维斯, 丹尼斯·J·邓普顿, 魏江, 泽耶夫·A·罗奈

附属公司

PMID： 20220133
预防性维修识别码：项目经理2863176
内政部： 10.1074/jbc。M110.121848号

JNK介导的Cdc25C磷酸化调节细胞周期进入和G（2）/M DNA损伤检查点

古斯塔沃·J·古铁雷斯等。生物化学杂志. 2010.

.2010年5月7日；285(19):14217-28.

doi:10.1074/jbc。M110.121848。 Epub 2010年3月10日。

作者

古斯塔沃·J·古铁雷斯¹, Toshiya Tsuji先生, 珍妮特·克罗斯, 罗杰·戴维斯, 丹尼斯·J·邓普顿, 魏江, 泽耶夫·A·罗奈

附属

¹信号转导项目，癌症中心，Sanford-Burnham医学研究所，美国加利福尼亚州拉霍亚市92037。

PMID： 20220133
预防性维修识别码：项目经理2863176
内政部： 10.1074/jbc。M110.121848号

摘要

c-Jun NH（2）末端激酶（JNKs）在细胞对各种应激信号的反应中起着核心作用。活化后，JNKs诱导底物磷酸化，从而控制增殖、迁移、存活和分化。最近的研究表明，JNK也可能在细胞周期控制中发挥作用，尽管其潜在机制在很大程度上尚未探索。这里我们显示，JNK在细胞周期的G（2）期直接磷酸化丝氨酸168处的Cdc25C。JNK对Cdc25C的磷酸化负向调节其磷酸酶活性，从而激活Cdk1，从而能够及时控制有丝分裂的开始。JNK的非限制性磷酸化，如细胞周期稳定的JNK形式或在一些人类肿瘤中所见，导致异常的细胞周期进展。此外，紫外线照射诱导的G（2）/M检查点需要通过JNK磷酸化使Cdc25C失活。Cdc25C和Cdc25A的JNK磷酸化在应激信号与未受干扰的细胞周期和检查点通路之间建立了新的联系。

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数字

**图1。**
**JNK对Cdc25C的细胞周期依赖性磷酸化。** A类，HeLa细胞通过淘洗分离，从淘洗细胞制备的提取物通过免疫印迹分析(*IB公司*)使用指示的抗体或通过JNK的免疫激酶分析。*G公司*FACS分析表明，分数1-4对应于间期细胞，分数5-10对应于有丝分裂期细胞(*底部工作台*). 这个星号是指54-kDa JNK2亚型，+是指HeLa细胞中存在的46-kDa-JNK1亚型。*GAPDH公司*，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；*IP（IP）*，免疫沉淀。B类，HeLa细胞转染血凝素(哈)-标记JNK2野生型或KEN缺失突变体，并通过胸苷-诺卡唑在前中期被捕(*国家石油公司*)协议，然后在指定的时间点发布。通过免疫印迹监测血凝素标记的JNK2和细胞周期蛋白B1的水平。Tubulin被用作负荷控制。C类,*在体外*如图所示，使用细菌纯化的重组蛋白和用于产生放射性标记蛋白的网织红细胞提取物，对JNKs和Cdc25C之间的结合进行分析。D类，HeLa细胞通过双胸腺嘧啶核苷阻滞沿细胞周期同步化(*数字电视广播*)单位：G₁/S，然后在18小时的动力学过程中使用所示抗体释放并通过免疫印迹分析。E类，显示的是与中类似的分析D类但细胞被分为细胞核和胞质提取物。B类和E类，图像来源于相同的凝胶/膜。

**图2。**
**JNK介导的Cdc25C磷酸化调节细胞周期。** A类，对表达所示质粒的HFF-1细胞进行48小时的FACS分析。G中细胞的百分比（%）₁、S和G₂/M表示为三个独立实验的平均值±S.D。B类，HeLa细胞转染FLAG标记的JNK2野生型(重量)或KEN缺失突变体24小时。制备有丝分裂细胞的细胞提取物（通过有丝分裂分离获得），并通过免疫印迹分析(*IB公司*)使用指示的抗体和Cdk1免疫激酶分析。*IP（IP）*，免疫沉淀。C类，HeLa细胞转染JNK2野生型(重量)或KEN缺失突变体，通过双胸苷阻断同步(*数字电视广播*)，并释放到细胞周期中，通过免疫印迹分析细胞周期蛋白B1、Cdc25C和丝氨酸168水平的磷酸化Cdc25C。D类，HFF-1细胞通过双胸苷块进行细胞周期同步化，并用空质粒（对照）、JNK2-ΔKEN突变体单独或与野生型Cdc25C、非磷酸化突变体（S168A）或Cdc25C的磷酸化突变型（S168D）进行核感染，如所示（条件*I–IV级*)，并通过免疫印迹或免疫激酶分析Cdk1（使用组蛋白H1作为底物）或JNK（使用谷胱甘肽*S公司*-转移酶(*消费税*)-标记c-Jun的N末端片段（氨基酸1-89）作为底物）。这个*底部面板*显示四种不同条件下的Cdk1活性(*I–IV级*)在同一凝胶中进行评估以进行比较。E类，HFF-1细胞用指定的质粒进行核感染48小时，固定，并染色微管蛋白和DNA，不同有丝分裂阶段的细胞百分比按照“实验程序”进行量化

**图3。**
**JNK调节Cdc25家族的成员。** A类，所示为*在体外*使用活性重组JNK和指示蛋白作为潜在底物进行磷酸化分析。这个星号指从细菌纯化中获得的全长蛋白质。B类图中显示了使用同步化HeLa细胞通过双胸腺嘧啶核苷阻断对细胞周期中细胞周期蛋白B1波动和Cdk1激活的分析（见“实验程序”）(*数字电视广播*)并在所示结构的表达下释放（条件I–IV）。这个图表显示了从DTB释放后8–12小时内Cdk1活性的量化。*底部的面板*显示四种条件下的Cdk1活性(*I–IV级*)在同一凝胶中进行评估。*IB公司*免疫印迹；*IP（IP）*，免疫沉淀。C类，显示了24小时后表达所示结构的HFF-1细胞的FACS分析。*消费税*，谷胱甘肽*S公司*-转移酶；*澳大利亚*，任意单位。

**图4。**
**细胞分裂需要JNK。** A类，MEF与双JNK1和JNK2敲除隔离(德科)用JNK2野生型小鼠进行短暂重组(重量)或JNK2-ΔKEN突变体。核感染后96 h进行Western blotting。所示培养物的生长曲线按照“实验程序”进行控制，控制。*IP（IP）*免疫沉淀；*消费税*，谷胱甘肽*S公司*-转移酶；*操作系统*，光密度。B类，所示为中所述培养物的Western blot和激酶活化分析A类在没有或有16h诺可唑治疗的情况下。C类，MEF如中所示A类细胞周期是否被阻滞在G₁通过血清饥饿阻断(*安全气囊系统*)通过添加新鲜培养基释放到细胞周期中，并通过免疫印迹法在指示动力学期间进行生化分析(*IB公司*)和免疫激酶反应。所描绘的三个面板的图像是由相同的凝胶/膜生成的。D类所示为所示MEF核感染48小时后进行的FACS分析。E类图中显示了从三种不同细胞系（HFF-1、A375和U87-MG）制备的提取物中细胞周期标记的比较₂/诺康唑治疗M（330 n米诺卡唑18小时），无论是否存在JNK激活。JNK抑制通过使用肽细胞通透性JNK抑制剂（VII）处理8小时或之前转染（24小时）磷酸化依赖激活环突变的未标记JNK2版本（Thr-183-Pro-Tyr-185到Ala-Pro-Phe）来实现(*APF公司*突变体）。在所有面板中星号表示54-kDa JNK2亚型，+表示这些细胞中存在的46-kDa-JNK1亚型。

**图5。**
**JNK-Cdc25C轴是G的一个组件₂/M DNA损伤检查点路径。** A类，用紫外线（40焦耳/米）处理的HeLa细胞²)在不存在或存在肽基JNK抑制剂的情况下，通过免疫印迹和JNK激酶反应（总提取物）在24小时内培养和分析。*IP（IP）*免疫沉淀；*消费税*，谷胱甘肽*S公司*-转移酶；*IB公司*，免疫印迹。B类，在24小时内对每种情况进行FACS分析和量化。C类，显示的是与中类似的分析A类在HeLa细胞中过度表达Cdc25C野生型(重量)或在60J/m后在丝氨酸168中形成Cdc25C突变形式²紫外线照射。*GAPDH公司*，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。D类，在24小时内对不同条件进行FACS分析。A类和C类，来自不同面板的特定免疫印迹或激酶分析图像来自同一凝胶/膜。在所有面板中星号是指54-kDa JNK2亚型，+是指HeLa细胞中存在的46-kDa-JNK1亚型。

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