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.2010年3月3日；30（9）：3409-18。
doi:10.1523/JNEUROSCI.4977-09.2010。

A53T转基因小鼠中不同区域特异性α-同核蛋白寡聚体：对神经退行性变的影响

埃尔皮达·齐卡 1, 玛丽亚·莫伊西杜, Jing Guo公司, 米米·库什曼, 帕特里克·甘农, 拉斐尔·桑达尔佐普洛斯, Benoit I Giasson公司, 迪米特里·克莱因, 哈里·伊斯奇罗普洛斯, 约瑟夫·马祖利
附属机构

A53T转基因小鼠中不同区域特异性α-同核蛋白寡聚体：对神经退行性变的影响

埃尔皮达·齐卡等。 神经科学. .

摘要

α-同核蛋白（alpha-syn）聚集是产生低聚物中间体的过程，是几种神经退行性疾病的常见病理特征。尽管低聚物α-同步体中间体在神经元功能中具有潜在的重要性，但其在体内的生化特性和病理生物学功能仍然非常未知。在这里，我们使用二维分析分离和一系列生化和基于细胞的分析来表征A53T alpha-syn转基因小鼠神经系统中存在的alpha-syn低聚物。确定的最突出的物种是53种A洗涤剂-可溶性低聚物，这些低聚物出现在神经症状出现之前，并且在含有α-同步蛋白内含物的区域以及组织学上未受影响的区域中发现同等数量的低聚物。这些低聚物对SDS、热和尿素具有抗性，但对蛋白酶-K消化敏感。尽管低聚物具有相似的基本生化特性，但从内含物携带区获得的低聚物对识别氧化的α-突触低聚物的抗体具有显著反应性，显著加速了α-突触在体外的聚集，并导致原发性皮层神经元变性。相反，从非内含物区域获得的低聚物没有毒性，并延迟了α-突触原纤维的体外形成。这些数据表明，在A53T alpha-syn转基因小鼠的不同脑区存在alpha-syn低聚物的特定构象。这些低聚物对神经元功能障碍发展的贡献似乎与它们的绝对量和基本生化特性无关，但取决于中间产物的组成和构象以及未被识别的脑-区域特异性内在因子。

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数字

图1。
图1。
有症状的A53Tα-syn转基因小鼠中Triton X-100不溶性α-syn-的区域特异性积累。一无症状（4-6月龄）和有症状（11-12月龄）A53Tα-syn转基因小鼠以及表达人类野生型α-syn-的11月龄转基因小鼠的组织用1%Triton X-100缓冲液（T可溶性）提取，然后使用人特异性抗α-syn单克隆抗体LB509进行Western blot分析。NSE用作负荷控制。TH是儿茶酚胺能区的标记物。分析包含α-syn损伤的区域[SC和小脑（Cr）]以及组织学上未受影响的区域[SN、OB和海马（H）]。b条用含有2%SDS（T不溶性）的缓冲液萃取Triton X-100馏分中的不溶性颗粒。Vimentin（Vim）被用作加载控制。左边的标记表示SDS-PAGE上已知分子量的标准物的流动性，单位为千道尔顿。c（c）免疫组织化学分析显示与α-syn病理包涵体相关的神经系统区域存在胶质增生。嗅球组织切片(A类,B类,E类,F类 )和脊髓(C类,D类,G公司,H（H）)从12个月大的nTg(A类,C类,E类,G公司 )和症状性A53Tα-syn转基因(B类,D类,F类,H（H） )用GFAP抗体对小鼠进行染色(A–D )或α-syn（syn505）(E–H（E–H） )syn505染色显示A53Tα-syn转基因小鼠脊髓中有丰富的α-syn-病理内含物(H（H）)嗅球中缺乏这种物质(F类)在nTg小鼠的组织中(E类,G公司). 抗GFAP抗体染色显示有症状的A53Tα-syn转基因小鼠脊髓中存在明显的胶质增生(D类)而A53Tα-syn转基因小鼠的嗅球(B类)以及nTg小鼠的组织(A类,C类)表现出较少的胶质增生。比例尺，100μm。
图2。
图2。
A53Tα-syn转基因小鼠α-syn-低聚物的鉴定和区域分布。对症状小鼠神经系统指示区域的Triton X-100可溶性提取物进行天然SEC处理。然后使用人特异性抗α-syn单克隆抗体syn211通过SDS-PAGE/Western blot分析SEC组分的α-syn。NSE用作负荷控制。α-Syn单体以对应于34的体积洗脱-Å-大小的颗粒，通过SDS-PAGE作为19kDa物种迁移。在36和113之间洗脱的高分子量低聚物Å。水平标记表示表观分子半径（单位：埃），对应SEC分析的球形蛋白标准物洗脱体积，而垂直标记表示SDS-PAGE上已知分子量的蛋白标准物的流动性（单位：千道尔顿）。显示了分析的每个区域的代表性斑点。右下角的图表显示了对有症状和无症状小鼠的SEC/SDS-PAGE印迹进行的定量密度分析，揭示了无症状和有症状小鼠组织中可溶性低聚物α-syn的相对水平相等。每个低聚物形式的定量分析如补充图2所示（可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。总α-syn低聚物水平表示为总可溶性α-syn.的百分比。平均值±SEM值；n个绘制所有组织的=3–5*第页=0.02，SC症状与Hipp症状，使用Tukey的单向方差分析事后（post-hoc）测试。还将所有内含物区域的低聚物组合水平与所有非内含物区域中的低聚体组合水平进行了比较，也未显示出统计上的显著差异（总低聚物百分比：内含物区域，44.1±9.4%，n个= 9; 无夹杂物区域，41.5±4.6%，n个= 28; 平均值±SEM值；第页=0.63，学生的t吨测试分析）。MW，分子量。
图3。
图3。
53例的生化分析Å 用SEC从A53Tα-syn转基因小鼠中分离出α-syn-低聚物。53对应的分数-Å-大小齐聚物显示在第2和第4道中，单体显示在每个印迹的第1和第3道中。一，将0.5 mg/ml的分馏裂解液与8米25°C下尿素1小时；b条，蛋白酶K，100μg/ml，37°C，30分钟。从SC（如图所示）或从有症状和无症状小鼠的OB中分离的低聚物的治疗结果相同。人特异性α-syn单克隆抗体LB509（此处显示）识别蛋白质C末端的一个表位（残基115-122）。用单克隆抗体syn208分析识别蛋白质淀粉样变区域的表位（残基87-110），得出了相同的结果。c（c）单克隆抗体syn303揭示了从含有内含物（SC）和无病理（OB）的区域分离出的低聚物之间的生化多样性，该单克隆抗体是针对氧化的α-syn产生的，优先识别人脑组织中具有α-syn-聚集体的α-ssyn低聚物形式（Duda等人，2002年）。
图4。
图4。
来自症状性A53Tα-syn转基因小鼠的α-syn低聚物对α-syn原纤维形成动力学的影响。重组纯化α-syn形成原纤维的动力学在体外使用淀粉样蛋白结合荧光染料硫黄素T进行评估，并以相对荧光单位（RFU）表示。一从SC中分离的低聚物显著降低了重组α-syn原纤维形成的滞后期；b条从OB中分离出的低聚物延长了原纤维形成的滞后期。用单克隆抗体syn211进行免疫沉淀，从低聚物组分中去除α-Syn。数值代表平均值±SEM(n个= 4–5; 双向方差分析*第页= 0.001, **第页= 0.05, ***第页= 0.01).c（c）使用免疫沉淀（I.P.）α-syn的syn211和种子试验中使用的OB中相应的免疫缺失（I.D.）组分进行Western blot分析（SC组分获得了类似的结果）。考马斯亮蓝（CBB）染色显示总蛋白含量相等。
图5。
图5。
体外来自症状性A53Tα-syn转基因小鼠脊髓的α-syn-低聚物的毒性。一在添加含有α-syn寡聚物的SEC组分后，通过Sapphire700（非特异性细胞溶质染色）和Draq5（核染色）联合测定小鼠原代皮层培养物的总细胞数和体积。b条神经节变性通过免疫染色定量神经丝水平进行评估。25毫摩尔HEPES/150 m米NaCl、pH 7.4（Buf）和来自Hipp的等效SEC馏分用作对照。将SC和OB的SEC部分与IgG或抗α-syn抗体（syn211）孵育，以耗尽α-syn-寡聚体，并确定神经变性是否由α-syn-1的存在介导(n个=每个时间点5-10*第页< 0.05). 图中显示了96周培养板扫描的Sapphire700/Draq5和神经丝的代表性免疫染色。c（c），通过免疫沉淀/Western blot分析测定从SC和OB-SEC组分中获得的α-syn低聚物的数量。使用单克隆抗体syn211或小鼠IgG作为对照，对样品进行免疫沉淀和印迹。通过密度测定法分析条带，发现条带相等（积分强度：OB，15.2；SC，15.3）。
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