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.2010年6月；333(3):650-62.
doi:10.1124/jpet.110.166256。 Epub 2010年3月2日。

基于荧光的筛选试验的实施将组胺H3受体拮抗剂氯苯丙胺和碘苯丙胺鉴定为亚单位选择性N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂

卡斯珀·B·汉森 1, 普拉塞达·穆拉塞里尔, 萨拉·达维特, 娜塔莉·库特卡亚, 袁宏杰, 凯蒂·万斯, 安娜·G·奥尔, Trine Kvist公司, 凯文·奥格登, 蓬莱, 金伯利·M·维拉诺, 列斯汀·刘易斯, 塞尔达尔·库特卡亚, 于洪都, Min Qui（最小奎）, T J墨菲, 詹姆斯·斯奈德, 汉斯·布伦·奥斯本, 斯蒂芬·特雷尼利斯
附属公司

实施基于荧光的筛选试验，将组胺H3受体拮抗剂氯苯丙酸和碘苯丙酸确定为亚单位选择性N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂

卡斯珀·B·汉森等。 药理学实验与治疗杂志. 2010年6月.

摘要

N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体是一种配体门控离子通道，在中枢神经系统兴奋性突触传递中调节缓慢的Ca（2+）渗透性成分，并在突触可塑性、神经元发育和一些神经疾病中发挥关键作用。我们描述了一种基于荧光的分析，该分析测量了在四环素诱导启动子（Tet-On）控制下，稳定表达NMDA受体NR2D和NR1的BHK-21细胞系中NMDA受体介导的细胞内钙变化。该分析通过使用超最大浓度的谷氨酸和甘氨酸选择性地识别变构调节剂，以尽量减少竞争性拮抗剂的检测。通过在来自两个小型重点库（包括商用药理活性化合物库）的1800个筛选化合物中成功识别已知的非竞争性但非竞争性NMDA受体拮抗剂，验证了该分析。通过二级筛选验证初级筛选的命中，二级筛选使用双电极电压灯记录非洲爪蟾卵母细胞中表达的重组NMDA受体。该策略确定了几种新的NMDA受体功能调节剂，包括组胺H3受体拮抗剂氯苯丙酸和碘苯丙酸，以及香草醛受体瞬时受体电位阳离子通道V亚家族成员1（TRPV1）拮抗剂辣椒碱。这些化合物是非竞争性拮抗剂，组胺H3受体配体对NR1/NR2B NMDA受体表现出亚摩尔效力，这增加了可以开发出同时对谷氨酸和组胺受体系统具有高效力的化合物的可能性。此外，体内组胺H3受体抑制引起的某些作用也可能涉及NMDA受体拮抗。

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数字

图1。
图1。
A、 多西环素48h后用抗NR1抗体免疫荧光观察NR1的诱导(DOX公司)治疗。二级抗体是异硫氰酸荧光素结合。对照组是指未经强力霉素处理，因此不表达NR1的细胞。B、 谷氨酸和甘氨酸（各50μM）激发期间表达NR1/NR2D的BHK-21细胞系的Fura-2成像。显示了谷氨酸和甘氨酸激发前（对照）和激发后Fura-2 340/380-nm激发和510-nm发射的比率图像。条形图（左侧）显示Ca2+信号强度范围为0至4 mM Ca2+（底部为0 mM Ca2+). C和D，在检测缓冲液中不存在和存在30μM竞争性甘氨酸拮抗剂7-CKA的情况下，NR1/NR2D细胞系中荧光反应的时间进程。在时间20 s时，将激动剂（蓝色正方形）、缓冲液（黑色三角形）或（+）-MK801（红色圆圈）添加到孔中。数据点显示为基线荧光的百分比100%×F类/F类基线，其中F类是添加到井后测得的荧光，以及F类基线是添加到井之前测得的平均荧光。数据点是四到五口井的平均值±S.D。最终激动剂浓度为100μM谷氨酸和1 mM甘氨酸。非竞争性开放通道阻滞剂（+）-MK801（10μM）用于抑制任何在添加激动剂之前激活的受体，从而揭示受体的基本活性。当将30μM 7-CKA添加到分析缓冲液中时，分析中几乎没有基本活性。
图2。
图2。
A、 组胺H3受体拮抗剂氯苯丙酸和碘苯丙酸的化学结构，以及香草酸受体TRPV1拮抗剂辣椒碱的化学结构。B、 典型的TEVC记录显示，增加氯苯丙酯浓度可抑制100μM谷氨酸和30μM甘氨酸对NR1/NR2B受体的反应X·莱维斯卵母细胞。轨迹上方的条形表示配体应用的持续时间。C至E，根据TEVC记录确定的NR1/NR2A（开环）、NR1/NR2B（开方阵）、NR1/1NR2C（闭环）和NR1/NR2D（闭方阵）处氯苯丙酸、碘苯丙酸和辣椒碱的浓度响应数据。数据为5至15个卵母细胞的平均值±标准误差。集成电路50表5列出了这些值。
图3。
图3。
通过TEVC记录表征重组NMDA受体的组胺受体配体的化学结构。另见表6。HTMT，组胺三氟甲基甲苯胺。
图4。
图4。
A、 NR1/NR2B受体的代表性TEVC记录X·莱维斯卵母细胞显示，将谷氨酸和甘氨酸的浓度分别从100和30μM（100/30）增加到500和150μM（500/150）并没有降低10μM卡普嗪的抑制程度。轨迹上方的条表示激动剂应用的持续时间。虚线框表示使用辣椒碱的持续时间。B到D，条形图显示氯苯丙胺、碘苯丙胺和辣椒碱在指定浓度下对NR1/NR2B的饱和激动剂浓度（100μM谷氨酸和30μM甘氨酸）和过饱和激动剂含量（500μM谷氨酰胺和150μM甘宁）的抑制反应。反应显示为对100μM谷氨酸和30μM甘氨酸单独反应的百分比（对照），是六个卵母细胞的平均±S.E.M。E到G，条形图和电流-电压关系曲线，显示氯苯丙酯、碘苯丙酯和辣椒碱在指示浓度下对膜电位为-60和+40 mV的NR1/NR2B反应的抑制。反应显示为对100μM谷氨酸和30μM甘氨酸单独（对照）的反应百分比，是四个卵母细胞的平均±S.E.M。电流-电压关系曲线归一化为−60 mV.H下的响应，柱状图显示碘苯哌啶（3μM）在−60和+40 mV膜电位下抑制NR1/NR2A响应。反应显示为对100μM谷氨酸和30μM甘氨酸单独（对照）的反应百分比，是四个卵母细胞的平均±S.E.M。电流-电压关系曲线归一化为−60 mV时的响应。星号（*）表示显著不同(t吨测试，P（P）< 0.05).
图5。
图5。
ifenprodil（绿色）与香草酸受体TRPV1拮抗剂capsazepine以及组胺H3受体拮抗剂clobenpropit和iodophenpropit的结构对齐。选择了ifenprodil的构象最佳最小化结构作为参考化合物，并对辣椒碱、氯苯丙酸和碘苯丙酸进行构象搜索并与ifenprodit重叠（参见材料和方法). 形状互补性是通过一个简单的T型s比较，得出0.0（无重叠）和1.0（相同形状）之间的分数。T型与ifenprodil相比，capsazepine、clobenpropit和iodophenpropit的s评分分别为0.72、0.77和0.73。辣椒碱、氯苯丙酸和碘苯丙酸的ROCS得分（包括形状和功能相似性成分）分别为1.09、1.02和0.99。
图6。
图6。
A、 条形图显示了氯苯丙酸和碘苯丙酸对NR1/NR2B-ΔATD的抑制作用，其中NR2B的氨基末端结构域已被删除，膜电位分别为-60和+40 mV。这两种化合物均表现出明显的电压依赖性抑制，表明它们是NR1/NR2-ΔADD的通道阻断剂。反应显示为对100μM谷氨酸和30μM甘氨酸单独反应的百分比（对照），是六个卵母细胞的平均±S.E.M。星号（*）表示显著不同(t吨测试，P（P）< 0.05). B、 氯苯丙胺在野生型NR1/NR2B（开环）、NR1/NR2-ΔATD（开环型）、NR1（N616R）/NR2B（闭环型）和NR1。NR1中的N616R突变解除了通道阻滞剂的电压依赖性抑制，因此氯苯丙酯以低效抑制NR1（N616R/NR2B-ΔATD。集成电路50表5列出了这些值。C、 条形图显示了ifenprodil（300 nM）对NR1/NR2B（突变体）的平均抑制，以及clobenpropit（3μM）对N1（N616R）/NR2B（突变）的平均阻止。这些突变对ifenprodil和clobenpropit的抑制作用惊人地相似。反应显示为对100μM谷氨酸和30μM甘氨酸单独（对照）的反应百分比，是4到10个卵母细胞的平均±S.E.M。
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