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.2010年3月16日；107(11):5018-23.
doi:10.1073/pnas.0913485107。 Epub 2010年3月1日。

果蝇parkin需要PINK1进行线粒体易位和泛素化丝裂原

埃琳娜·齐维亚尼 1, 冉娜涛, 亚历山大·J·惠特沃斯
附属公司

果蝇parkin需要PINK1进行线粒体易位和泛素化丝裂原

埃琳娜·齐维亚尼等。 美国国家科学院程序. .

摘要

E3泛素连接酶Parkin的缺失导致早发性帕金森病，一种病因不明的神经退行性疾病。Parkin与多种细胞过程有关，包括蛋白质降解、线粒体稳态和自噬；然而，其在发病机制中的确切作用尚不清楚。最近的证据表明，Parkin被招募到受损的线粒体中，可能影响线粒体的分裂和/或融合，以调节其自噬周转。招募的确切机制和泛素化目标尚不清楚。这里，我们在果蝇细胞中显示，PINK1需要招募Parkin进入功能失调的线粒体并促进其降解。此外，PINK1和Parkin介导线粒体外表面的大量因子Mfn的泛素化。果蝇PINK1或Parkin的缺失导致体内Mfn丰度增加，并伴随线粒体的伸长。这些发现提供了PINK1/Parkin途径影响线粒体分裂/融合的分子机制，正如先前的遗传相互作用研究所建议的那样。我们假设Mfn泛素化可能提供了一种机制，通过这种机制，最终受损的线粒体被标记并隔离，以通过自噬进行降解。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
果蝇PINK1和停车场活性促进线粒体分裂和/或抑制融合。(A类)用指定的RNAi探针处理S2R+细胞3天。罗丹明123用于观察活细胞中的线粒体形态。(B类)用质粒转染S2R+细胞以表达指示基因，并用有丝分裂生长因子使线粒体可视化(C类和D类)线粒体长度的量化如图所示A类和B类分别是。两种对照（ctrl）RNAi和仅载体治疗显示出表型变异。（比例尺：5μm）条形图表示至少三个独立实验的平均值和sem。通过Bonferroni校正的单因素方差分析确定显著性(**P（P）<0.01***P（P）<0.001）。
图2。
图2。
粉红色1是Parkin易位和有丝分裂所必需的。(A类)与共转染的S2R+细胞派金-GFP和有丝分裂红色，用对照dsRNA处理，然后用CCCP或百草枯处理并固定用于成像。大多数Parkin-GFP点与（箭头）或毗邻（箭头）线粒体共定位(B类)用指示的dsRNAs处理细胞，并将其暴露于CCCP中24 h。样品固定并染色，以标记线粒体（抗复合物Vα，红色）、肌动蛋白（卵磷脂-488，绿色）或细胞核（Hoechst，蓝色）。(C类)S2R+细胞转染为A类并用粉红色1暴露于CCCP或百草枯前的dsRNA。不同图像分析方法下Parkin-GFP分布的比较如所示图S5(D类)具有Parkin-GFP斑点的细胞百分比。（比例尺：5μm）条形图表示至少四个独立测试的平均值和SEM。通过带Bonferroni校正的单向方差分析确定显著性(***P（P）<0.001）。
图3。
图3。
在体外和体内，Mfn以PINK1/Parkin依赖的方式泛素化。(A类)与共转染的S2R+细胞HA-Ub型加上空向量或标记的标志百万分之一,图纸1，或Opa1公司将所示质粒进行免疫沉淀并进行Western blot分析。(B类)S2R+细胞接受对照处理，停车场、和粉红色1转染前的RNAi如图所示。收集细胞并进行Western blot分析，如图所示。还对样品进行免疫沉淀，并用针对Flag和HA的抗体探测西方机器人。(C类)表达空载体组合的S2R+细胞的免疫沉淀物，派金-GFP、和Mfn-Flag公司如图所示。(D类)蛋白质印迹分析果蝇属体内Mfn水平。所有样品中的非特异性条带均表示为“ns”。复合物Vα和肌动蛋白用作负荷控制。基因型：周1118，野生型；Mfn RNAi，da-GAL4、UAS-Mfn-RNAi; Mfn过度表达，da-GAL4，UAS-Mfn; Mfn过度表达公园25,da-GAL4，UAS-Mfn，公园25/公园25; 公园25,公园25/公园25在所有面板中，黑色箭头表示全长Mfn，星号表示泛化Mfn、白色箭头表示全长Opa1、白色钻石表示泛化Opa1，白色箭头表示通长Drp1。
图4。
图4。
在缺乏PINK1的情况下，Parkin过度表达可导致Mfn泛素化。(A类)S2R+细胞用对照或粉红色1RNAi探针并转染空载体组合，派金-GFP、和Mfn-Flag公司，如图所示。(B类)S2R+细胞用对照或停车场RNAi探针并转染空载体组合，PINK1-myc码、和Mfn-Flag公司，如图所示。收集细胞并使用所示的特异性抗体进行Western blot分析。
图5。
图5。
没有PINK1/Parkin时Mfn累积(A类)按照指示用RNAi探针处理S2R+细胞，收获细胞，并使用抗果蝇属Mfn公司。抗复合物Vα和肌动蛋白的抗体用作负荷控制。(B类)收集野生型和突变型动物，并进行蛋白质印迹分析。基因型：周1118，野生型；Mfn RNAi，da-GAL4号机组,UAS-Mfn-RNAi公司; 公园25,公园25/公园25; 粉红色1B9公司,粉红色1B9公司/年S2R+细胞中与复合物Vα负荷控制相关的Mfn水平量化(C类)野生型和突变型动物(D类). 图表表示三个独立实验的平均值和SEM。通过带Bonferroni校正的单向方差分析确定显著性(**P（P）<0.01***P（P）<0.001）。
图6。
图6。
Mfn缺失部分损害Parkin向线粒体的转运。S2R+细胞与表达质粒共转染派金-GFP和有丝分裂红色并用对照RNAi探针或Mfn公司在接受CCCP或百草枯治疗前进行RNAi探针检测，并分析Parkin-GFP的积累。对照RNAi处理细胞如图2所示。(A类)Mfn公司RNAi处理的细胞暴露于CCCP、百草枯或无应激。每个治疗都显示了两个代表性图像，以显示差异性。（比例尺：5μm）(B类)带有绿色斑点的单元格百分比。该图显示了至少四个独立井田的平均值和SEM，每个井田包含70–90个单元。通过带Bonferroni校正的单向方差分析确定显著性(*P（P）< 0.05, ***P（P）<0.001）。
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参考文献

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