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.2010年6月；38(10):3196-208.
doi:10.1093/nar/gkq030。 Epub 2010年2月3日。

MSK1多蛋白复合物通过丝氨酸28或丝氨酸10的H3磷酸化介导即刻早期基因的启动子染色质重塑

博扬·德罗比克 1, 比阿特丽斯·佩雷斯·卡达亚, 中国人俞景文, Sam Kam-Pun Kung先生, 詹姆斯·戴维
附属公司

MSK1多蛋白复合物通过丝氨酸28或丝氨酸10的H3磷酸化介导即刻早期基因的启动子染色质重塑

博扬·德罗比克等。 核酸研究. 2010年6月.

摘要

ERK和p38 MAPK通路激活后，MSK1/2介导的核小体反应，包括丝氨酸28或10处的H3磷酸化，与即时早期（IE）基因转录的诱导相耦合。这种反应的结果因刺激和细胞环境而异，从肿瘤转化到神经元突触可塑性。在这里，我们对小鼠成纤维细胞10T1/2和MSK1敲低10T1/2细胞进行了顺序免疫共沉淀试验和顺序染色质免疫沉淀（ChIP）试验，以表明H3丝氨酸28和10磷酸化导致启动子重塑。MSK1与磷酸-胺适配器14-3-3蛋白和BRG1（SWI/SNF重塑器的ATP酶亚基）形成复合物，通过转录因子如Elk-1或NF-kappaB招募到靶基因的启动子。在MSK1介导的H3磷酸化后，BRG1通过14-3-3蛋白与靶基因的启动子相关，这些蛋白充当支架。招募的SWI/SNF在IE基因启动子处重塑核小体，使转录因子如JUN结合并开始转录。

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数字

图1。
图1。
TPA诱导的MSK1募集和H3磷酸乙酰化六月,考克斯-2和化石1监管区域。(A类)的示意图六月,考克斯-2和化石1显示ChIP分析中扩增区域的基因。根据正向引物相对于转录起始位点的5′位置标记每个区域。外显子用方框表示，并显示位于扩增区域的相关转录因子的结合位点。CTF，CCAAT-结合蛋白（也称为NF1，核因子1）；CRE，环状AMP响应元件；C/EBP、CCAAT增强子结合蛋白；EBS、Ets结合位点；GC，GC盒，是Sp家族转录因子的结合位点；TRE，TPA响应元件；SRE，血清反应元件。AP-1由JUN、FOS和ATF转录因子家族成员形成的二聚体组成。星号表示假定的结合位点。(B类)使用MSK1、H3S10ph、H3S28ph或H3K9acK14ac的抗体，在用TPA处理过0、15或30分钟的血清缺乏的10T1/2细胞制备的甲醛交联单核小体上进行ChIP实验。通过实时定量PCR定量等量输入和免疫沉淀DNA。富集值是三个独立实验的平均值，误差条代表标准偏差。
图2。
图2。
TPA诱导14-3-3蛋白和染色质重塑剂/修饰剂的招募六月,考克斯-2和化石1监管区域。ChIP实验是使用针对14-3-3ε、14-3-3ζ、BRG1或PCAF的抗体在甲醛交联单核小体上进行的，该单核小体由经TPA处理0、15或30分钟的血清缺乏的10T1/2细胞制备而成。富集值是通过对等量输入和免疫沉淀DNA的实时定量PCR分析获得的，是三个独立实验的平均值，误差条代表标准偏差。
图3。
图3。
MSK1，14-3-3蛋白和BRG1复合物的形成以及TPA诱导的MSK1、14-3-3蛋白质和染色质重塑剂/修饰剂的共存六月,考克斯-2和化石1监管区域。(A类)将1 mg 10T 1/2（左面板）或500μg HEK293（中面板）总细胞提取物的等分样品与抗14-3-3ζ、抗MSK1或抗BRG1抗体孵育。或者，从用TPA刺激30分钟并用DTBP处理的缺血10T1/2细胞中提取的1 mg总细胞提取物依次与抗MSK1和抗BRG1抗体孵育（右图）。在SDS–10%-PAGE上解析整个“结合”和“非特异”部分以及相当于25μg总细胞提取物的“输入”和“未结合”部分的等效体积，并用指示抗体（IB）进行免疫印迹。(B类)Re-ChIP实验是在用TPA处理0或30分钟的血清饥饿的10T1/2细胞制备的甲醛交联单核小体上进行的。按照指示使用抗体。通过实时定量PCR定量等量输入和免疫沉淀DNA。5′近端序列的富集值六月(−146),考克斯-2（−111）和化石1（−187）基因是三个独立实验的平均值，误差条代表标准偏差。
图4。
图4。
H89对TPA诱导的核小体反应和染色质重塑/修饰物募集的抑制作用六月,考克斯-2和化石15′近端调控区。(A类)在TPA刺激前0、15或30分钟，用H89预处理或不预处理血清饥饿的10T1/2细胞。制备甲醛交联单核小体，并用MSK1、H3S10ph、H3S28ph、14-3-3ε、14-3-3-ζ、BRG1、PCAF或H3K9acK14ac抗体用于ChIP分析。通过实时定量PCR定量等量输入和免疫沉淀DNA。5′近端序列的富集值六月(−146),考克斯-2（−111）和化石1（−187）基因是三个独立实验的平均值，误差条代表标准偏差。(B类)在TPA刺激前，用H89预处理血清饥饿的10T1/2细胞0或30分钟。用抗MSK1抗体孵育1 mg总细胞提取物的等分样品。在SDS–10%-PAGE上解析整个“结合”和“非特异”部分以及相当于25μg总细胞提取物的“输入”和“未结合”部分的等效体积，并用指示抗体（IB）进行免疫印迹。
图5。
图5。
H89对TPA诱导的JUN募集的抑制作用六月,考克斯-2和化石1监管区域。在TPA刺激0、15或30分钟之前，用H89预处理或不预处理血清饥饿的10T1/2细胞。制备甲醛交联单核小体，并用抗JUN抗体用于ChIP分析。通过对等量输入和免疫沉淀DNA进行实时定量PCR分析获得的富集值是三个独立实验的平均值，误差条代表标准偏差。
图6。
图6。
MSK1是核小体反应和14-3-3亚型、染色质重塑和转录因子在细胞调节区的募集所必需的六月,考克斯-2和化石1使用针对H3S10ph、H3S28ph、14-3-3ε、14-3-3-ζ、BRG1或JUN的抗体进行的ChIP实验(A类)和re-ChIP实验，使用指示的抗体(B类)在甲醛交联的单核小体上进行，所述单核小体由用TPA处理0或30分钟的血清饥饿的MSK1敲低和对照10T1/2细胞制备。通过实时定量PCR定量等量的输入和免疫沉淀的DNA。5′近端序列的富集值六月(−146),考克斯-2（−111）和化石1（−187）基因是三个独立实验的平均值，误差条代表标准偏差。
图7。
图7。
示意图模型，表示MSK1和14-3-3在IE基因重塑和诱导对MAPK信号的响应中的作用。MSK呈红色大卵圆形，14-3-3呈绿色部分卵圆形，与SWI/SNF染色质重塑剂复合。沿着DNA的灰色椭圆代表核小体，NF-κB转录因子（p65/p50二聚体）显示为一对紫色/橙色的椭圆，与NF-κ的B结合位点（蓝色椭圆）结合。为了响应ERK和p38 MAPK通路的激活，MSK1多蛋白复合物被转录因子（如Elk1、NF-κB或C/EBPb）招募到IE基因的调控区域。MSK1磷酸化H3 S10或H3 S28，显示H3S10ph（黄色圆圈）。H3S10ph和H3S28ph招募14-3-3蛋白，其介导染色质重塑者SWI/SNF的招募，BRG1是ATP酶亚单位。随后启动子核小体的重塑允许转录因子如AP-1进入启动子靶序列。起始前复合物在TATA盒（黄色三角形）处被招募，转录的起始如下所示，RNAPII S5ph的存在就很明显。
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