Dexamethasone induces dysferlin in myoblasts and enhances their myogenic differentiation

doi:10.1016/j.nmd.2009.12.003

.2010年2月；20(2):111-21.

doi:10.1016/j.nmd.2009.12.003。 Epub 2010年1月18日。

地塞米松在成肌细胞中诱导dysferrin并增强其肌源性分化

约瑟夫·贝兰托¹, 西尔维亚·迪亚兹·佩雷斯, 克拉拉·马扎尔, 米歇尔·麦克斯韦, 亚塞米·伊尔马兹, 凯西·托普, Guney Boso公司, 卡特里奥纳·H·杰米森, 尼古拉斯·A·卡卡兰诺, 克里斯蒂娜·A·M·杰米森

附属公司

PMID： 20080405
预防性维修识别码：项目经理2856642
内政部： 2016年10月10日/j.nmd.2009.12.003

地塞米松在成肌细胞中诱导dysferrin并增强其肌源性分化

约瑟夫·贝兰托等。神经肌肉疾病. 2010年2月.

.2010年2月；20(2):111-21.

doi:10.1016/j.nmd.2009.12.003。 Epub 2010年1月18日。

作者

约瑟夫·贝兰托¹, 西尔维亚·迪亚兹·佩雷斯, Clara E Magyar公司, 米歇尔·麦克斯韦, 亚塞米·伊尔马兹, 凯西·托普, Guney Boso公司, 卡特里奥纳·H·杰米森, 尼古拉斯·A·卡卡兰诺, 克里斯蒂娜·A·M·杰米森

附属

¹加利福尼亚大学洛杉矶分校泌尿系，美国加利福尼亚州洛杉矶市大卫·格芬医学院，邮编90095。

PMID： 20080405
预防性维修识别码：项目经理2856642
内政部： 2016年10月10日/j.nmd.2009.12.003

摘要

糖皮质激素对许多肌营养不良症有益，但在治疗肌萎缩症方面无效，这是一种由肌萎缩素丧失引起的罕见的肌萎缩病。我们通过研究糖皮质激素对成肌细胞系C2C12和缺乏dysferrin的C2C12分化的影响，试图了解这种差异的分子基础。我们发现，药理学剂量的地塞米松增强了C2C12s的肌源性融合效率，增加了dysferrin的诱导，以及特定的肌源转录因子、肌膜和结构蛋白。相反，缺乏dysferrin的C2C12细胞系表现出长肌管减少和特定肌肉分化蛋白（最显著的是肌球蛋白重链）的早期诱导。地塞米松部分逆转了去甲肾上腺素缺乏的C2C12细胞中肌源性融合的缺陷。我们假设，糖皮质激素的一个关键治疗益处可能是上调作为糖皮质激素增强肌源性分化的重要组成部分的dysferrin。

PubMed免责声明

数字

图1
肌源性融合效率，显示单个核细胞、含有两个或三个核的细胞以及含有四个或更多核的细胞内细胞核的百分比。Dex处理的细胞显示出肌管形成的显著增加，这一点可以从含有四个或更多细胞核的细胞中的细胞核明显增加而得到证明。在切换到分化培养基三天后，从未处理的细胞中总共计数了1930个细胞核，从Dex处理的C2C12-1细胞中计数了2116个细胞核。误差条表示标准误差。P值大于P<0.05被认为是显著的。

图2
实时PCR分析在存在或不存在100nM-Dex的情况下生长的C2C12-1细胞中的mRNA水平。A.在分化过程的第1-5天，与溶媒对照组相比，Dex处理显著增加了C2C12-1细胞中的dysferrin mRNA水平。在第6天和第7天，mRNA水平的差异并不显著。B.Dex处理显著增加了增殖过程中的myoferrin mRNA水平。在切换到分化培养基后，mRNA水平的差异趋于平缓，培养物之间没有显著差异。C.相对MyoD mRNA水平。D.相对肌生成素mRNA水平。基于对六个候选参考基因的geNorm分析，将mRNA水平归一化为参考基因GAPDH和eEF1ε1。qPCR数据以相对于第1天载体对照处理的C2C12-1细胞的折叠诱导图表示，这些细胞来自三次分析，每次重复三次。误差条表示标准误差。大于p<0.05的差异用*表示，并被视为显著差异。

图3
在存在或不存在100nM Dex的情况下，对C2C12时间进程中的dysferrin和肌源蛋白进行Western blot分析。与溶媒对照组相比，Dex治疗组在分化的时间进程中提前增加了C2C12细胞的dysferrin蛋白水平。C2C12-1细胞与载体对照（-）或100nM Dex（+）培养，并从时间过程的每天（第1-7天）制备蛋白质提取物。收获第2天的时间点后，其余培养物在第3-7天从增殖培养基切换到分化培养基。每个时间点加载60微克蛋白质，样本成对加载：每个时间点的负Dex和正Dex。“C”代表小鼠肌肉控制提取物。GAPDH蛋白水平显示为负荷控制。免疫印迹下方显示了归一化为相应内部控制GAPDH带的每个dysferrin带中像素强度的比率。

图4
经载体对照或100nM-Dex处理的C2C12-1细胞中dysferrin的免疫荧光和共焦显微镜图像。与载体对照处理的细胞相比，Dex处理增加了dysferrin水平并增加了C2C12-1肌管的大小。A.时间进程第2天C2C12-1的免疫荧光显微镜图像。C2C12-1细胞在增殖介质中生长，载体控制（顶部面板）或100nM Dex（中部和底部面板），100倍放大。B.时间进程第6天C2C12-1细胞的共聚焦显微镜图像：载物控制（顶部面板）和100nM Dex（底部面板），40×，bar代表75μm。兔抗dysferrin多克隆抗体与Texas Red-conjugated二级抗体联合使用。所有样品均用核染色DAPI进行复染。

图5
肌源性融合效率在缺乏dysferrin的C2C12细胞中降低。在切换到分化培养基三天后（时间进程的第5天）测定肌源性融合效率。图中显示了DAPI染色的细胞核出现在结蛋白免疫染色的单核细胞内、含有两个或三个细胞核的细胞内以及含有四个或更多细胞核的细胞中的百分比。A.与亲本C2C12 P9细胞相比，即使使用Dex治疗，Dysferlin缺陷的C2C12细胞（shRNA）显示成熟肌管（4个或更多细胞核）的肌源性融合减少。B.在存在或不存在100nM Dex的情况下，亲代C2C12 P9细胞和缺乏dysferrin的C2C12细胞的代表性免疫荧光图像显示在下部面板中。结蛋白免疫染色呈绿色，DAPI呈蓝色。共有1926个细胞核和2672个细胞核分别从溶媒对照处理的亲本C2C12 P9和dysferrin缺乏的C2C12中计数。共有1780个细胞核和2178个细胞核分别从Dex处理的亲本C2C12 P9和失铁蛋白C2C12中计数。误差条表示标准误差。P值大于P＜0.05被认为是显著的。

图6
以GAPDH作为分化时间过程（第1-7天）中每天的负荷对照，对用载体对照（-）或100nM-Dex（+）处理的亲代C2C12 P9细胞和缺乏dysferlin的C2C12细胞中的dysferin和肌源性分化蛋白进行Western blot分析。A.亲代C2C12细胞（P9）。B.Dysferlin缺乏的C2C12细胞（shRNA）。

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