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.2010年3月19日;285(12):8719-32.
doi:10.1074/jbc。M109.077081。 Epub 2010年1月11日。

上皮细胞粘附分子调节与人类胚胎干细胞未分化表型的维持相关

附属公司

上皮细胞粘附分子调节与人类胚胎干细胞未分化表型的维持相关

东营路等。 生物化学杂志. .

摘要

人类胚胎干细胞(hESCs)是一种独特的多能干细胞,能够自我更新并分化为所有三个胚层。迄今为止,需要更多能够可靠识别人胚胎干细胞的细胞表面标记物。上皮细胞粘附分子(EpCAM)是一种I型跨膜糖蛋白,在多种祖细胞群和癌症中表达。在异种移植研究中,它被用于富集具有肿瘤起始活性的细胞。在这里,我们通过免疫荧光显微镜、Western blotting和使用抗EpCAM单克隆抗体(mAb)OC98-1的流式细胞术全面分析了EpCAM的表达。我们发现EpCAM由未分化的hESCs而不是分化的hESCs高度选择性表达。一旦人胚胎干细胞分化,EpCAM的蛋白和转录水平迅速降低。这种沉默与EpCAM启动子组蛋白修饰的自由基转化密切相关。此外,我们还证明组蛋白3的赖氨酸27三甲基化的动态模式是由SUZ12和JMJD3相互作用形成的,两者都参与维持hESC的多能性。此外,我们使用染色质免疫沉淀分析来阐明EpCAM对几个重编程基因的直接调控,包括c-MYC、OCT-4、NANOG、SOX2和KLF4,以帮助维持hESCs的未分化。总之,我们的结果表明EpCAM可能被用作人类胚胎干细胞的表面标记。EpCAM的表达可能受表观遗传机制调控,并与维持人胚胎干细胞的未分化状态密切相关。

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数字

图1。
图1。
EpCAM由人胚胎干细胞选择性表达。 A类相对荧光强度的剂量依赖性增加与未分化hESCs细胞表面抗EpCAM单抗(OC98-1)浓度的增加有关(顶部H9、hES5和HUES6)。仅EpCAM与30天分化的人胚胎干细胞结合的基础水平(H9-压差。,hES5-差异。,以及HUES6-差异。)可以在中看到下部面板hESCs的分化如“实验程序”所述。B类未分化和分化hESCs中EpCAM蛋白的表达。用抗EpCAM和抗α微管蛋白单克隆抗体对不同hESCs细胞株的裂解产物进行Western blot分析。α-管蛋白被用作内部对照。C类,EpCAM的免疫荧光分析()和OCT-4蛋白(ii(ii)iv(四))未分化H9中的表达(ii(ii))和分化H9(iv(四))单元格。细胞核用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚复染(DAPI公司) (蓝色). H9细胞OCT-4染色显示这些hESCs保持未分化状态。未分化H9中EpCAM的表达与OCT-4的表达相关(ii(ii)). 人胚胎干细胞分化与EpCAM和OCT-4表达缺失相关(iv(四)).
图2。
图2。
人类ES细胞分化与EpCAM丢失相关。 A类,评估未分化H9细胞的细胞表面EpCAM表达直方图(左边)荧光流式细胞术检测H9细胞分化5、10和15天。EpCAM或SSEA4是一个封闭群体,而二级抗体只是一个开放群体。使用正向和侧向散射对活细胞进行门控,数据代表该群体的细胞。B类,Q-RT-PCR分析10月4日EpCAM,以及COL3A1系列如上所述,在未分化的H9细胞和分化5、10和15天的H9电池中评估转录表达。GAPDH表达用于规范化每个模板加载中的变异性。
图3。
图3。
细胞表面EpCAM的表达和hESCs的分离。 A类未分化的人胚胎干细胞(H9、hES5、HUES3和HUES6)和使用抗EpCAM单克隆抗体(**,第页< 0.01).B类H9人胚胎干细胞与MEF共培养的EpCAM流式细胞术分析(顶部)仅MEF(中间的)和单用MEF分析CD29(底部).C类用荧光流式细胞术分析与MEF共培养的H9细胞表面EpCAM的表达。D类E类,双标记EpCAM阳性(D类)和EpCAM阴性(E类)与MEF共同培养的未分化H9细胞上具有抗SSEA4和抗CD29抗体的人群。
图4。
图4。
甲基化状态EpCAM公司未分化和分化的人胚胎干细胞中的启动子区域。 A类,的示意图EpCAM公司基因启动子区。指出了研究中使用的MSP和亚硫酸氢盐测序引物。B类,MSP分析EpCAM公司未分化和分化H9细胞中的基因启动子区域。甲基化的PCR产物(M(M))是由甲基化特异性引物产生的,而那些是非甲基化的(U型)由非甲基化DNA特异性引物产生。C类,绘制基因启动子区CpG岛甲基化状态EpCAM公司亚硫酸氢盐测序基因。每个属于正方形表示从扩增亚硫酸氢盐处理的DNA产生的PCR产物中克隆和测序的单个质粒。开放式方块,非甲基化胞嘧啶;填充的正方形甲基化胞嘧啶。未分化和分化H9细胞启动子区的大多数CpG均未甲基化。
图5。
图5。
组蛋白修饰EpCAM公司未分化和分化hESCs中的启动子。 顶部,的示意图EpCAM公司基因启动子区域,相对于TSS跨越位置−630到+967。研究中使用的ChIP引物如下所示水平线。A–D,结合ChIP和Q-PCR分析显示H3K4me3的定量占有率(A类),H3K9K14Ac(B类),H3K27me3(C类)和H3K9me3(D类)至EpCAM公司10月4日未分化和分化H9细胞中的启动子。10月4日作为组蛋白修饰结合的阳性对照。每项实验一式三份(平均值±S.D.)。通过实时PCR定量免疫沉淀靶的数量,并计算免疫沉淀靶值,即IP DNA与用于免疫沉淀的输入DNA总量(IP/输入)的比值。为了获得相对倍富集值,目标IP/输入被进一步归一化为HBB(H3K4me3或H3K9K14Ac)或GAPDH(H3K27me3或H3G9me3)的控制启动子区域的水平。在ChIP分析中,在TSS下游的未分化H9细胞中观察到H3K4me3和H3K9K14Ac的富集,而在TSS上游和下游的分化的H9细胞(*,第页< 0.05).
图6。
图6。
染色质修饰剂SUZ12和JMJD3的招募EpCAM公司未分化和分化hESCs中的启动子。 顶部,的示意图EpCAM公司启动子位点,相对于TSS跨越位置−630到+967。研究中使用的ChIP引物如下所示水平线。A类B类,染色质样本用抗SUZ12抗体免疫沉淀(A类)或抗JMJD3抗体(B类),并丰富了EpCAM公司KRT1公司通过Q-PCR对启动子进行定量。KRT1公司用作SUZ12/JMJD3/H3K27me3绑定的控件。每项实验一式三份(平均值±S.D.)。免疫沉淀靶点的值计算为IP DNA与总输入DNA(IP/input)的比值。目标IP/输入进一步归一化为HBB(SUZ12)或GAPDH(JMJD3)的控制启动子区域,以获得-倍的富集值。通过ChIP测量,SUZ12与EpCAM公司分化H9细胞TSS上游和下游的启动子均升高。相反,未分化H9细胞中TSS下游的JMJD3结合强度的定量增加(*,第页< 0.05).
图7。
图7。
EpCAM调节c-MYC公司,10月4日,NANOG公司,SOX2标准,以及KLF4型帮助维持胚胎干细胞的干细胞。 A类Q-RT-PCR分析未分化H9细胞和分化5、10和15天的H9细胞的mRNA表达。表达水平归一化为内部对照GAPDH。B类,EpCAM结合的定量ChIP分析c-MYC公司发起人(*,第页< 0.05).C类,EpCAM结合的定量ChIP分析10月4日,NANOG,SOX2,以及KLF4型发起人(*,第页< 0.05). 实验一式三份(平均值±S.D.)。
图8。
图8。
EpCAM信号通路示意图。人胚胎干细胞中EpCAM的表达受表观遗传调控。EpCAM的信号转导是通过EpICD转位到细胞核来实现的,它与c-MYC、OCT-4、NANOG、SOX2,以及KLF4型发挥其对维持ES细胞干细胞状态的影响。

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