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.2010年1月；176(1):482-95.
doi:10.2353/ajpath.2010.090510。 Epub 2009年12月11日。

静脉基底膜普遍表达基质蛋白低表达区：多组织特征和炎症过程中的重塑

马修·贝诺（Mathieu-Beno）t Voisin 1, 多丽丝·普罗贝尔, 苏珊·努尔沙格
附属机构

静脉基底膜普遍表达基质蛋白低表达区：多组织特征和炎症过程中的重塑

马修·贝诺（Mathieu-Beno）t Voisin等。 美国病理学杂志. 2010年1月.

摘要

小静脉基底膜在维持血管完整性方面起着关键作用，通过其密集且高度组织化的基质蛋白网络，还对大分子和迁移的白细胞起着强大的屏障作用。然而，白细胞可以穿透炎症部位的小静脉基底膜，尽管相关的体内机制尚不清楚。使用整体免疫染色组织和共聚焦显微镜，我们证明多个器官的小静脉基底膜表达低基质蛋白（层粘连蛋白-511和IV型胶原）沉积的区域，这些区域被称为低表达区域（LERs）。在所分析的多个组织中（例如，提睾肌、皮肤、肠系膜组织），LER与相邻周细胞之间的间隙直接对齐，并且在小静脉中更常见。正如其任性所预测的那样，LER在所研究的所有炎症反应中充当中性粒细胞迁移的“大门”（由白三烯B（4）、CXCL1、肿瘤坏死因子[TNF]α、内毒素和缺血/再灌注损伤引起），这种反应与层粘连蛋白-511和IV型胶原LER的大小增加有关。迁移的中性粒细胞对层粘连蛋白呈阳性染色，但对IV型胶原无阳性染色，表明不同基底膜网络的重塑存在不同的机制。总的来说，这些发现进一步揭示了微静脉基底膜内的特殊区域的特征，这些区域优先由迁移中性粒细胞使用和重塑。

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数字

图1
图1
大静脉关键微静脉基底膜成分的表达谱。收集、固定未经刺激的小鼠提睾肌，并对小静脉基底膜的不同成分进行整体免疫染色，然后通过共焦显微镜进行分析。面板显示了半毛细血管后微静脉的代表性三维图像（使用Imaris软件重建），免疫染色用于层粘连蛋白-α5链（Lmα5，检测层粘连素-511亚型）、层粘连蛋白质-α4链（Lm-α4，检测层粘连蛋白-411亚型(顶部面板)，和αSMA(中间面板)作为周细胞的标记物。图像显示了基底膜LER与周细胞鞘中αSMA阴性区域之间的直接联系(圈子). 相比之下，来自cremasteric小静脉的图像已经对perlecan和αSMA进行了免疫染色，显示在具有αSMA（周细胞）表达区域的基底膜中存在perlecan LERs。底部面板中的直方图表示所示血管段沿线感兴趣的基底膜成分（绿色）和周细胞（红色）的强度分布(黄色虚线图像上）显示LER(闭合箭头)除珍珠糖外，所有被调查的蛋白质都与αSMA阴性区域（周细胞之间的间隙）共定位(胰头). 所有图像均代表从4至6只小鼠中分析的至少4条血管，比例尺=10μm。
图2
图2
不同血管床层粘连蛋白-511 LER的检测与分析。收集、固定小鼠提睾肌、皮肤、肠系膜组织、腹膜壁和膈肌（均未刺激），并进行整体免疫染色，以通过共焦显微镜进行分析。面板显示了从上述组织中对层粘连蛋白-α5链（Lmα5，左侧面板)和αSMA(右侧面板)以分别检测小静脉基底膜（层粘连蛋白-511同种型）和周细胞。具有光谱颜色编码的图像的相应强度轮廓（蓝色表示低强度位置，红色表示高强度位置）也显示为插入图像显示存在低表达区域(圈子)在所有分析组织的微静脉基底膜中，与αSMA阴性区域一致的位置（即周细胞之间的间隙）。这些图像代表了来自4种以上动物的至少4条血管。比例尺=10μm。
图3
图3
层粘连蛋白-511和IV型胶原LER的尺寸特征。对小鼠全套组织（提睾肌、耳部皮肤和肠系膜组织）进行层粘连蛋白-α5链或IV型胶原和αSMA免疫染色，分别检测微静脉基膜和周细胞，并用共焦显微镜进行分析。答：图中显示了所分析组织的毛细血管后微静脉中相邻周细胞与层粘连蛋白-511和IV型胶原LER之间的间隙面积。中位数由虚线表示。显著差异用线条表示*P（P）< 0.05; **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001.B类：图表显示了不同大小层粘连蛋白-511 LER区域（μm）的表达频率（%）2)对3种不同组织进行分析。1至10μm范围内LER面积的百分比2（长肌、皮肤和肠系膜）或1至40μm2（肠系膜）显示在双头箭头结果表示为平均值±SEM，通过分析每个组织至少4条血管共2059个LER获得；每组至少4只小鼠。
图4
图4
低表达区的特征。用免疫染色法对整只小鼠的提睾肌、皮肤和肠系膜组织进行血管壁成分的染色，并用共焦显微镜分析小静脉基底膜的特征。答：图表显示了相邻周细胞之间间隙的数量/单位面积(左侧面板)，层粘连蛋白-511（Lmα5链，中间面板)和IV型胶原蛋白(右侧面板)LER在所示组织的微静脉基底膜中定量。显著差异用线条表示*P（P）< 0.05; **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001.B类：该图显示了血管直径与乳糜泻、皮肤和肠系膜小静脉中层粘连蛋白-511 LER的数量/单位面积之间的显著线性关系。抄送：该图显示了LER的大小与托儿所肌肉毛细血管后微静脉（每个点代表一条单独的血管）的直径之间的线性相关性。医生：共焦图像是一个三维重建（Imaris）基底膜，来自一个半乳糜样毛细血管后微静脉，对层粘连蛋白-α5链进行染色，并使用光谱色码显示（蓝色和红色分别表示低强度和高强度区域）。选定的小静脉段显示不同大小的LER（标记为1到3）。这些LER的相应区域显示在图像上，层粘连蛋白-α5染色的相应强度分布沿着虚线箭头如下图所示（条形图，10μm）。电子邮箱：该图显示了LER的平均大小与乳突肌（开放圈）和皮肤（填充圈）多个小静脉（每个点代表单个血管）的平均强度之间的线性关系。相关图中的虚线表示95%的置信区间。所有显示的结果都来自n个=3至4只小鼠的2至4条血管。
图5
图5
由多种炎症反应引起的中性粒细胞通过长静脉基底膜低表达区迁移。为了分析LERs在中性粒细胞迁移中的作用和表达调控，通过交叉内注射CXCL1（500ng）2小时、TNFα（300ng）或LPS（300ng）4小时来刺激cremaster肌。随后对组织进行IV型胶原或Lmα5链（层粘连蛋白-511基底膜标记物）、αSMA（周细胞标记物）和MRP-14（中性粒细胞标记物。答：用Imaris软件生成具有代表性的半血管三维图像，观察受刺激静脉中中性粒细胞的迁移。B类：面板中所示微静脉的代表性纬度横截面（1μm厚）A类分析了与LER相关的迁移中性粒细胞的定位以及与中性粒细胞相关的LER的强度分布。图像显示，迁移的中性粒细胞通过周细胞间隙和LER迁移(实心箭头). 每个图像下方显示了Lmα5免疫染色的相应强度曲线，以证明中性粒细胞穿过的LER中的荧光和基质蛋白含量的损失。这个开放箭头显示似乎不被中性粒细胞重塑的LER，与中性粒细胞转移的LER相比，荧光强度更高。抄送：这些图像显示了LPS刺激组织的长静脉的1μm横截面，免疫染色了层粘连蛋白411（Lmα4链）、αSMA和MRP-14，表明中性粒细胞可以通过层粘连素411 LER迁移(实心箭头). 图像下方显示了层粘连蛋白-α4免疫染色的相应强度分布，以证明中性粒细胞穿过的LER与未穿过的LER-α4相比，荧光损失(打开的箭头). 所有图像均代表每组5-6只小鼠的4条血管，bar=10μm。
图6
图6
中性粒细胞迁移与微静脉基底膜层粘连蛋白-511和IV型胶原LER的重塑有关。答：LTB刺激小鼠长肌4(10−7mol/L）2小时，CXCL1（500 ng）2小时或TNFα（300 ng）4小时。随后对组织进行固定，对小静脉基底膜（层粘连蛋白-α5链或IV型胶原）和中性粒细胞（MRP-14）进行整体免疫染色，并通过共焦显微镜观察。面板显示中性粒细胞向组织迁移(左侧面板)层粘连蛋白-511 LER（Lmα5，中间面板)和IV型胶原LER的大小（Col IV，右侧面板)，在不同的炎症情况下。B类：小鼠长肌受到缺血（30分钟）/再灌注（120分钟）损伤，如上所述，中性粒细胞反应(左侧面板)层粘连蛋白-511和IV型胶原LER的重塑(中间的和右侧面板）进行量化。抄送：将小鼠耳朵皮内注射TNFα4小时，解剖固定，免疫染色后分析中性粒细胞迁移(左侧面板)和基底膜重塑(右侧面板)如上所述。所有结果均来自4条血管（每组5至6只小鼠），数值表示为平均值±SEM。与对照条件相比，受刺激组织的反应存在显著差异*P（P）< 0.05; **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001.
图7
图7
LPS诱导层粘连蛋白-511 LER的时间依赖性重塑，这与中性粒细胞而非单核细胞通过小静脉壁的迁移有关。CX3CR1的乳肌绿色荧光粉/+用LPS（300 ng）刺激小鼠，在炎症诱导后的不同时间点（2、4、6和24小时）收集组织，对小静脉基底膜（层粘连蛋白-α5链）和中性粒细胞（MRP-14）进行固定和整体免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。LER的大小(A类)，中性粒细胞(B类)，和单核细胞(C类)随着时间的推移，反应被量化。白细胞在小静脉壁内的定位(左侧面板)在血管外组织中(右侧面板)也进行了量化。所有结果均来自至少4条血管（每组5至6只小鼠），数值以平均值±SEM表示。与对照条件相比，受刺激组织的反应存在显著差异*P（P）< 0.05; **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001. 两个不同时间点之间的显著差异用线条表示*P（P）< 0.05; **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001.
图8
图8
迁移的中性粒细胞呈层粘连蛋白-511和层粘连素-411阳性，但不呈IV型胶原阳性。长期借款4-固定LPS刺激的托马斯特肌，对感兴趣的分子进行整体免疫染色，然后通过共焦显微镜进行分析。所示图像是LTB后乳突静脉的三维重建4（2小时，顶部面板)或LPS（4小时，底部面板)中性粒细胞（MRP-14）和层粘连蛋白-511亚型（Lmα5；A类)，层粘连蛋白411亚型的层粘连蛋白-α4链（Lmα4；B类)或IV型胶原（Col IV；C类). 图像显示，迁移的中性粒细胞对层粘连蛋白-α5和层粘连蛋白质-α4链呈阳性染色(实心箭头)但IV型胶原蛋白阴性(开放箭头)在细胞表面。在中间面板中性粒细胞（MRP-14）的荧光强度采用不透明滤光片，使细胞半透明，以便检测中性粒细胞上的免疫染色基膜成分。所有图像均来自至少4条血管（每组4至6只小鼠）。棒材=10μm。
图9
图9
微静脉基底膜成分的异质性表达谱由微静脉壁周细胞覆盖率决定。示意图说明了这样一种现象，即小静脉基底膜的特征取决于这种结构是由小静脉的细胞成分（即内皮细胞[ECs]和周细胞）生成的。具体来说，与内皮细胞的汇合层不同，周细胞在内皮细胞周围以松散和“网状”方式表达，周细胞的“斑块状”表达模式导致关键基底膜成分的异质性。总的来说，小静脉的两种细胞成分的形态和表达谱决定了小静脉基底膜的结构特性，这两种成分都有助于小静脉基底膜成分的产生，尤其是LER的存在和特征，它们通常位于相邻周细胞之间的间隙内(圈子).
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