A cassette of N-terminal amino acids of histone H2B are required for efficient cell survival, DNA repair and Swi/Snf binding in UV irradiated yeast

doi:10.1093/nar/gkp1074

.2010年3月；38(5):1450-60.

doi:10.1093/nar/gkp1074。 Epub 2009年12月9日。

组蛋白H2B的N端氨基酸盒是紫外线照射酵母中高效细胞存活、DNA修复和Swi/Snf结合所必需的

罗尼塔·纳格¹, 麦肯娜·克里斯, 约翰·W·斯默登, 约翰·J·威里克, 迈克尔·J·斯默登

附属公司

PMID： 20007597
预防性维修识别码：项目经理2836547
内政部： 10.1093/nar/gkp1074

组蛋白H2B的N端氨基酸盒是紫外线照射酵母中高效细胞存活、DNA修复和Swi/Snf结合所必需的

罗尼塔·纳格等。核酸研究. 2010年3月.

.2010年3月；38(5):1450-60.

doi:10.1093/nar/gkp1074。 Epub 2009年12月9日。

作者

罗妮塔·纳格¹, 麦肯娜·克里斯, 约翰·W·斯默登, 约翰·J·威里克, 迈克尔·J·斯默登

附属

¹美国华盛顿州立大学分子生物科学学院生物化学与生物物理系，华盛顿州普尔曼，邮编：99164-7520。

PMID： 20007597
预防性维修识别码：项目经理2836547
内政部： 10.1093/nar/gkp1074

摘要

高电荷组蛋白N末端结构域参与核小体间和核小体内的相互作用，并包含大量用于翻译后修饰的位点。我们研究了从酵母细胞组蛋白H2B N末端结构域中删除残基30-37对紫外线照射后核苷酸切除修复（NER）的影响，因为这些细胞对紫外线非常敏感。我们发现H2B Delta30-37细胞在三个特定的染色质位点表现出NER效率降低：转录活性的RPB2位点；转录沉默的核小体负载HML位点；以及转录抑制、非沉默的GAL10基因座。核酶消化研究表明，H2B Delta30-37染色质增加了核小体的可及性和/或核小体的移动性。此外，在相同剂量的紫外线照射下，与wt细胞相比，H2B Delta30-37突变体获得更多的DNA损伤。降低H2B Delta30-37细胞中的损伤水平以匹配wt细胞的损伤水平，可将RPB2和GAL10基因座的NER率恢复到wt水平，但沉默HML基因座中的NER效率仍然较低。有趣的是，H2B Delta30-37细胞中HML位点的Snf5募集减少，紫外线照射后更短暂。这可能反映了SWI/SNF复合物与H2B Delta30-37核小体的结合亲和力较低。

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数字

**图1。**
净入学率*HML、RPB2*和*镀锌10*基因座。对于修复实验，细胞受到紫外线照射（100 J/m²)并在黑暗中孵育不同时间段（0.5–2小时）。分离基因组DNA，用适当的限制性内切酶消化，然后用T4内切酶V消化完成。使用放射性标记的特异探针进行南部分析*HML、RPB2*和*镀锌10*基因座。用于2.3 kb中CPD含量（T4 endo V切割）的代表性碱性琼脂糖凝胶*英国标准普尔*1286I碎片(*HML公司*)，2.2 kb EcoRI–EcoRV片段(*加仑10*)和3.4kbNru公司I碎片(*RPB2型*)如所示(A类,C类和E类)分别是。计算的CPD从*HML、RPB2*和*镀锌10*位置如所示(**B、 D类**和F类)分别是。对于每个应变，数据表示三个独立实验的平均值±1 SD。

**图2。**
CPD的形成*HML、RPB2*和*镀锌10*基因座。为了量化CPD，用增加的UV剂量照射细胞，立即采集，并用T4 endo V消化基因组DNA，以完成对CPD的定量分析*RPB2，镀锌10*和*HML公司*基因座。每个片段形成的CPD数量的图形表示*RPB2，镀锌10*和*HML公司*位置如所示(**A、 B**和C类)分别是。对于每个应变，数据表示三个独立实验的平均值±1 SD。

**图3。**
总基因组DNA中的CPD和6-4光产物形成。对于全基因组CPD和6-4光产物定量，如图2图例中所述，对细胞进行紫外线照射，并用CPD或6-4PP特异性抗体对基因组DNA进行缝隙杂交。使用同一膜的Southern分析来校正槽之间的负载差异，并得出每个菌株的CPD和6-4PP的相对数量。基因组中形成的CPD和6-4PP数量的图形表示如所示(A类和B类)分别是。对于每个应变，数据表示三个独立实验的平均值±1 SD。

**图4。**
H2BΔ30–37突变细胞中的NER，其DNA损伤水平与重量细胞。H2BΔ30–37和重量细胞以70焦耳/米的紫外线剂量照射²和100焦耳/米²分别进行修复培养。然后用位点特异性限制酶消化基因组DNA，然后进行T4内切V消化，如前所述。CPD从*RPB2型*,*镀锌10*和*HML公司*位置是(**A、 B**和C类)分别是。对于每个应变，数据表示三个独立实验的平均值±1 SD。

**图5。**
H2B突变染色质的MNase消化模式。(A类)分离的球形体来自重量如“材料和方法”一节所述，用不同浓度的MNase处理H2BΔ30–37细胞，并在1.2%琼脂糖凝胶上分离基因组DNA，每隔一道都有100 bp重复标记片段（新英格兰生物实验室），以便于测量核小体重复长度。用溴化乙锭对大块染色质的消化谱进行染色。(B类)分离的球形体来自重量分别用不同浓度的MNase处理H2BΔ3–32、H2B△3–37和H2B△30–37细胞，分离基因组DNA，然后在1.2%琼脂糖凝胶上分离。M、 D和T分别表示单、双核和三核小体DNA群体的位置。突变染色质消化物中显著的亚单体带的位置用“*”表示。

**图6。**
位点特异染色质分析。MNase消化模式(A类)大块染色质，用溴化乙锭染色。M、 D和T分别表示单、双核和三核小体DNA群体。用探针进行Southern杂交(B类)*镀锌10*(C类)*HML公司*和(D类)*RPB2型*基因座。

**图7。**
组蛋白在*HML公司*H2BΔ30–37细胞中的位点。ChIP用于测量(A类)组蛋白H2B和(B类)组蛋白H3在*HML公司*基因座。误差线表示三个不同实验平均值的±1 SD。H2B或H3水平在重量和H2BΔ30–37电池(*P（P）*> 0.05). (C类)酵母示意图*HML公司*位点，包括核小体（灰色椭圆）的位置和用于ChIP实验的引物集（水平线A、B和C）。垂直箭头表示染色体III上的位置。

**图8。**
在NER期间向特定染色质位点招募Snf5。不同染色质区域Snf5蛋白募集的ChIP分析重量NER期间H2BΔ30–37细胞。细胞受到紫外线照射并培养不同的修复时间。用Snf5特异性抗体免疫沉淀染色质，然后使用基因特异性引物进行定量PCR扩增。Snf5在*HML公司*,*RPB2型*和*电话5*位置如所示(**A、 B**和C类)分别是。维修期间的Snf5招募标准化为维修后0小时的Snf占用率。对于每个应变，数据表示三个独立实验的平均值±1 SD。

**图9。**
H2B残基30–37在核小体核心结构中的位置。核小体核心颗粒结构的侧视图显示组蛋白H2B残基30–37（黄色）的位置穿过DNA超螺旋（紫色）的两个螺旋之间。该图像是使用PYMOL绘制的。

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