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.2010年1月19日；49（2）：304-11。
doi:10.1021/bi901627u。

SIRT3对哺乳动物线粒体琥珀酸脱氢酶活性的调节

侯赛因磁门 1, 韩敏俊, 杨永杰, 羌童, 哈桑·科克, 埃米恩·科克
附属公司

SIRT3对哺乳动物线粒体琥珀酸脱氢酶活性的调节

侯赛因磁门等。 生物化学. .

摘要

NAD（+）依赖性脱乙酰酶SIRT3的sirtuin家族成员被鉴定为位于哺乳动物线粒体中的主要线粒体脱乙酰酶之一，负责几种代谢酶和氧化磷酸化组分的脱乙酰化。SIRT3对蛋白质脱乙酰化的调节对线粒体代谢、细胞存活和寿命至关重要。在本研究中，我们在SIRT3基因敲除小鼠中鉴定了复合物II亚基之一琥珀酸脱氢酶黄素蛋白（SdhA）亚基作为新的SIRT3底物。通过串联质谱法绘制了几个乙酰化赖氨酸残基的图谱，我们确定了乙酰化在SIRT3敲除小鼠中复合物II活性中的作用。与复合物I的SIRT3依赖性激活一致，我们观察到SdhA亚基的脱乙酰化增加了野生型小鼠的复合物II活性。此外，我们用烟酰胺和山奈酚处理K562细胞株，分别抑制SIRT3的脱乙酰酶活性和刺激SIRT3表达。与对照细胞和烟酰胺处理细胞相比，刺激SIRT3表达降低了SdhA亚单位的乙酰化水平，并增加了经卡恩佩罗处理的细胞中复合物II的活性。对猪和鸡的SdhA晶体结构中乙酰化残基的评估表明，SdhA亲水表面的乙酰化可能控制底物进入蛋白质活性部位并调节酶活性。我们的发现构成了通过SdhA亚基的可逆乙酰化调节复合物II活性的第一个证据，SdhA亚基是NAD（+）依赖性脱乙酰酶SIRT3的新底物。

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数字

图1
图1。在SIRT3基因敲除小鼠肝线粒体中检测新的SIRT3底物SdhA
乙酰化蛋白和SIRT3的表达苏尔特3+/+,苏尔特3+/−、和苏尔特3−/−用各种抗体对小鼠肝线粒体进行免疫印迹分析。A）按照材料和方法所述制备的线粒体裂解物在SDS-PAGE上分离，并用N-乙酰赖氨酸（N-乙酰K）抗体进行免疫印迹检测线粒体蛋白乙酰化增加。作为等负荷的对照，用Hsp60抗体进行蛋白质印迹。B）用SIRT3抗体进行免疫印迹分析，检测野生型或SIRT3缺陷小鼠肝脏或分离的肝线粒体中的SIRT3蛋白水平。同时检测线粒体蛋白MnSOD和细胞质蛋白微管蛋白作为对照。C）约2mg苏尔特3−/−将小鼠肝线粒体裂解物分层放置在34%的蔗糖垫上，并分成五层（蔗糖垫的顶部和底部部分如箭头所示）。在SDS-PAGE凝胶上分离等量的每个组分，并通过免疫印迹分析检测每个组分中的乙酰化蛋白。总数苏尔特3−/−对垫上分层的小鼠肝线粒体裂解物（ML）进行分析，以确定组分中乙酰化蛋白的位置。箭头显示了SIRT3底物谷氨酸脱氢酶（GDH）和琥珀酸脱氢酶黄蛋白亚基（SdhA）的位置。D）约50μl的馏分3苏尔特3+/+或苏尔特3−/−用2D凝胶分离小鼠肝线粒体，用N-乙酰赖氨酸抗体检测乙酰化蛋白。与考马斯蓝染色凝胶斑点相对应的乙酰化2D-gel斑点在凝胶内消化并通过质谱鉴定。用SdhA抗体免疫印迹法确认质谱法测定的蛋白质鉴定。
图1
图1。在SIRT3基因敲除小鼠肝线粒体中检测新的SIRT3底物SdhA
乙酰化蛋白和SIRT3的表达苏尔特3+/+,苏尔特3+/−、和苏尔特3−/−通过使用各种抗体的免疫印迹分析来评估小鼠肝线粒体。A）按照材料和方法所述制备的线粒体裂解物在SDS-PAGE上分离，并用N-乙酰赖氨酸（N-乙酰K）抗体进行免疫印迹检测线粒体蛋白乙酰化增加。作为等负荷的对照，用Hsp60抗体进行蛋白质印迹。B）用SIRT3抗体进行免疫印迹分析，检测野生型或SIRT3缺陷小鼠肝脏或分离的肝线粒体中的SIRT3蛋白水平。同时检测线粒体蛋白MnSOD和细胞质蛋白微管蛋白作为对照。C）约2mg警报器3−/−将小鼠肝线粒体裂解物分层放置在34%的蔗糖垫上，并分成五层（蔗糖垫的顶部和底部部分如箭头所示）。在SDS-PAGE凝胶上分离等量的每个组分，并通过免疫印迹分析检测每个组分中的乙酰化蛋白。总数苏尔特3−/−对垫上分层的小鼠肝线粒体裂解物（ML）进行分析，以确定组分中乙酰化蛋白的位置。箭头显示了SIRT3底物谷氨酸脱氢酶（GDH）和琥珀酸脱氢酶黄蛋白亚基（SdhA）的位置。D）约50μl的馏分3苏尔特3+/+或苏尔特3−/−用2D凝胶分离小鼠肝线粒体，用N-乙酰赖氨酸抗体检测乙酰化蛋白。与考马斯蓝染色凝胶斑点相对应的乙酰化2D-gel斑点在凝胶内消化并通过质谱鉴定。用SdhA抗体免疫印迹法确认质谱法测定的蛋白质鉴定。
图2
图2。在保守的K179、K485、K498和K538残基上SdhA的乙酰化
A）对SIRT3基因敲除小鼠线粒体中SdhA的2D-gel斑点进行LC-MS/MS分析，检测乙酰化肽的CID谱。B）小鼠SdhA乙酰化肽及其不同物种同源物的一级序列比对。人、牛、猪、鸡和大肠杆菌SdhA与小鼠SdhA的乙酰化肽对齐。（*）表示LC-MS/MS分析中检测到的乙酰化赖氨酸残基。该比对是在Biology Workbench中使用CLUSTALW程序创建的，并在BOXSHADE中显示。C）鸡SdhA（PDB#1YQ3）的晶体结构模型，代表所有四个亚基SdhA、SdhB、SdhC和SdhD（分别为黄色和粉红色）。在小鼠SdhA中发现乙酰化的保守Lys残基（在B中用星号表示）被涂成红色。
图2
图2。在保守的K179、K485、K498和K538残基上SdhA的乙酰化
A）对SIRT3基因敲除小鼠线粒体中SdhA的2D-gel斑点进行LC-MS/MS分析，检测乙酰化肽的CID谱。B）小鼠SdhA乙酰化肽及其不同物种同源物的一级序列比对。人、牛、猪、鸡和大肠杆菌SdhA与小鼠SdhA的乙酰化肽对齐。（*）表示LC-MS/MS分析中检测到的乙酰化赖氨酸残基。该比对是在Biology Workbench中使用CLUSTALW程序创建的，并在BOXSHADE中显示。C）鸡SdhA（PDB#1YQ3）的晶体结构模型，代表所有四个亚基SdhA、SdhB、SdhC和SdhD（分别为黄色和粉红色）。在小鼠SdhA中发现乙酰化的保守Lys残基（在B中用星号表示）被涂成红色。
图2
图2。在保守的K179、K485、K498和K538残基上SdhA的乙酰化
A）对SIRT3基因敲除小鼠线粒体中SdhA的2D-gel斑点进行LC-MS/MS分析，检测乙酰化肽的CID谱。B）小鼠SdhA乙酰化肽及其不同物种同源物的一级序列比对。将人、牛、猪、鸡和大肠杆菌SdhA与小鼠SdhA的乙酰化肽进行比对。（*）表示在LC-MS/MS分析中检测到的乙酰化Lys残基。该比对是在Biology Workbench中使用CLUSTALW程序创建的，并在BOXSHADE中显示。C）鸡SdhA（PDB#1YQ3）的晶体结构模型，代表所有四个亚基SdhA、SdhB、SdhC和SdhD（分别为黄色和粉红色）。在小鼠SdhA中发现乙酰化的保守Lys残基（在B中用星号表示）被涂成红色。
图3
图3。SdhA乙酰化对琥珀酸脱氢酶（复合物II）活性的调节
SdhA的过度乙酰化降低了SIRT3基因敲除小鼠的Complex II活性。A）从Sirt3获得等量的裂解物+/+,苏尔特3+/−、和苏尔特3−/−用12%SDS-PAGE分离小鼠肝线粒体，并用N-乙酰赖氨酸（N-乙酰基K）、SdhA和Hsp60抗体进行检测。B）复合物II活性作为DCIP还原速率进行测量，在600 nm处使用来自苏尔特3+/+和苏尔特3−/−小鼠肝线粒体。星号表示p<0.005。
图4
图4。SIRT3过表达对SdhA脱乙酰化和复合物II活性的作用
SIRT3在HIB1B细胞中的过度表达通过SdhA的脱乙酰化增加了复合物II的活性。A）从稳定表达标记截断（tSIRT3）和全长（fSIRT3。使用图3A中描述的抗体和Flag-tag抗体进行免疫印迹分析。B）对从对照（Cont）、烟酰胺（Nam）和山奈酚（Kaem）处理的细胞中获得的K562细胞裂解物进行免疫印迹分析。将每个样品中约20μg的对照和处理过的K562细胞裂解物加载到12%的SDS-PAGE上，并如上所述进行免疫印迹。肌动蛋白和Hsp60印迹显示可确保蛋白质通道中的负载相等。C）等量（约2mg）的对照和处理的K562细胞裂解物分层于34%蔗糖垫上，高速离心后分馏成8-1 mL小份。将等量的每个组分（-8）进行丙酮沉淀，并加载到12%SDS-PAGE凝胶上进行免疫印迹分析。箭头显示乙酰化蛋白与SdhA信号重叠的位置。D）使用不同量的山奈酚和烟酰胺处理的K562细胞裂解物监测复合物II的活性。分析一式三份，所示值为平均值±SD。
图4
图4。SIRT3过表达对SdhA脱乙酰化和复合物II活性的作用
SIRT3在HIB1B细胞中的过度表达通过SdhA的脱乙酰化增加了复合物II的活性。A）从稳定表达Flag标记的截短型（tSIRT3）和全长（fSIRT3）的对照和HIB1B细胞中分离线粒体，并在12%SDS-PAGE上从每个细胞系中分离出约20μg的线粒体裂解物。用图3A中描述的抗体和Flag-tag抗体进行免疫印迹分析。B）对从对照（Cont）、烟酰胺（Nam）和山奈酚（Kaem）处理的细胞中获得的K562细胞裂解物进行免疫印迹分析。将每个样品中约20μg的对照和处理过的K562细胞裂解物加载到12%的SDS-PAGE上，并如上所述进行免疫印迹。肌动蛋白和Hsp60印迹显示可确保蛋白质通道中的负载相等。C）等量（约2mg）的对照和处理的K562细胞裂解物分层于34%蔗糖垫上，高速离心后分馏成8-1 mL小份。将等量的每个组分（-8）进行丙酮沉淀，并加载到12%SDS-PAGE凝胶上进行免疫印迹分析。箭头显示乙酰化蛋白与SdhA信号重叠的位置。D）使用不同量的山奈酚和烟酰胺处理的K562细胞裂解物监测复合物II的活性。分析一式三份，所示值为平均值±SD。
图4
图4。SIRT3过表达对SdhA脱乙酰化和复合物II活性的作用
SIRT3在HIB1B细胞中的过度表达通过SdhA的脱乙酰化增加了复合物II的活性。A）从稳定表达标记截断（tSIRT3）和全长（fSIRT3。使用图3A中描述的抗体和Flag-tag抗体进行免疫印迹分析。B）对从对照（Cont）、烟酰胺（Nam）和山奈酚（Kaem）处理的细胞中获得的K562细胞裂解物进行免疫印迹分析。将每个样品中约20μg的对照和处理过的K562细胞裂解物加载到12%的SDS-PAGE上，并如上所述进行免疫印迹。肌动蛋白和Hsp60印迹显示可确保蛋白质通道中的负载相等。C）等量（约2mg）的对照和处理的K562细胞裂解物分层于34%蔗糖垫上，高速离心后分馏成8-1 mL小份。将等量的每个组分（-8）进行丙酮沉淀，并加载到12%SDS-PAGE凝胶上进行免疫印迹分析。箭头显示乙酰化蛋白与SdhA信号重叠的位置。D）使用不同量的山奈酚和烟酰胺处理的K562细胞裂解物监测复合物II的活性。分析一式三份，所示值为平均值±SD。
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