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.2009年11月；7（11）：e1000249。
doi:10.1371/journal.pbio.1000249。 Epub 2009年11月24日。

错误的转录延伸导致混合血统白血病

多萝西·米勒 1, 玛丽亚·帕斯·加西亚·库拉尔, 克里斯庭·巴赫, 塞巴斯蒂安·布尔, 伊曼纽尔·梅特纳, 罗伯特·K·斯莱尼
附属公司

错误的转录延伸导致混合血统白血病

多萝西·米勒等。 公共科学图书馆生物. 2009年11月.

摘要

由组蛋白甲基转移酶混合白血病（MLL）和多种不相关的融合伙伴组成的融合蛋白是高度致白血病的。尽管它们普遍存在，尤其是在儿童急性白血病中，但其转化机制的许多分子细节尚不清楚。在这里，我们对MLL融合的功能提供了机制上的见解，证明它们捕获了一种转录延伸复合物，该复合物先前已被发现与11-19白血病蛋白（ENL）相关。我们表明，这种复合物由一个通过递归蛋白质相互作用稳定的紧密核心组成。该中心部分整合组蛋白H3赖氨酸79甲基化、RNA聚合酶II（RNA Pol II）磷酸化和MLL融合伙伴，以刺激转录延伸，如RNA系链分析所示。共免疫沉淀表明，MLL融合融合到这个复合物中，导致MLL靶位点的伸长活性的结构性补充。同源盒基因A簇的染色质免疫沉淀（ChIP）证实了MLL融合的结合与转录水平之间的密切关系。利用条件MLL融合的时间分辨ChIP将H3K79甲基化作为与目标表达相关的主要参数。MLL融合蛋白的存在也使RNA Pol II保持活跃的拉长状态，并阻止抑制组蛋白甲基化在靶染色质上的积累。即使在强制分化条件下，在MLL融合活性存在的情况下，Hox基因座仍保持开放和多产。最后，MLL转化的细胞对RNA Pol II磷酸化的药理学抑制特别敏感，这表明MLL有潜在的治疗方法。总之，我们发现异常转录延伸是致癌转化的一种新机制。

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数字

图1
图1。EAP综合体的核心结构。
EAP核心和稳定蛋白质相互作用的示意图。描述了EAP核心的组成、蛋白质相互作用基序以及EAP催化的酶反应。请注意适当标记N端和C端的单个蛋白质取向。为了清楚起见，只显示了一个RNA Pol II重复序列（YSPTSPS）。实线标记蛋白质-蛋白质相互作用域。无法描绘Dot1l中CyclinT2结合位点的确切N末端范围，因此，该边界由虚线表示。组蛋白H3与ENL的YEATS结构域的相互作用已在前面描述过。给出了每个蛋白质各自参考序列的计算分子量。数字表示各个相互作用域的各自氨基酸残基。缩写如下：AF4，4号染色体上的ALL1融合基因（也称为MLLT1或AFF1）；ALF、AF4-LAF4-FMR2同源区；CDK9，细胞周期蛋白依赖性激酶9；CHD，C末端同源结构域；cyc盒、cyclin盒；细胞周期蛋白T2；H、 富含组氨酸；Dot1l，端粒沉默样干扰因子；ENL，11-19白血病；组蛋白H3；H3K79met，组蛋白H3赖氨酸79甲基转移酶结构域；hydp，疏水区；五十、 富含亮氨酸；KRM，富含赖氨酸-精氨酸的基序；NHD，N-末端同源结构域；NLS，核定位信号；P、 脯氨酸富集区；Ser，富含丝氨酸的结构域；YETS、Yaf9、ENL、AF9、Taf14和Sas5保守域。
图2
图2。EAP对伸长率的刺激。
（A） RNA系链分析的机制。由改良的HIV LTR启动子驱动的荧光素酶报告子用于检测伸长刺激。将Rev RNA识别位点（IIb干环）嫁接到TAR Tat-recognition环上。通过Rev连接到RNA的蛋白质只有在能够招募活性pTEFb（细胞周期蛋白T1或T2和CDK9的二聚体）时，才会释放停滞的RNA Pol II并产生荧光素酶活性。（B） Rev融合蛋白的表达。将ENL、AF4、AF5及其衍生物融合到Rev并在293T细胞中表达。用Rev特异性抗体检测细胞裂解物。为了检测Rev-MLL融合蛋白，使用了抗MLL抗体。（C） 与MLL融合伙伴的RNA系链分析结果。如图所示，Rev或Rev融合与TAR-IIb报告基因一起表达，并测定荧光素酶活性。图形表示中的方框对应于图1中的蛋白质-蛋白质相互作用域。数值表示三次试验的平均值和标准偏差，并仅用Rev表示与背景相关的数值。（D） MLL融合蛋白的延伸活性。如图所示，Rev与MLL融合蛋白的嵌合体在（C）所述的RNA系链分析中进行了测试。
图3
图3。将MLL融合蛋白并入EAP。
（A） MLL-ENL与EAP成分的共免疫沉淀。MLL-ENL（MLL-ENL），一种缺乏ENL（MLL-ENL）最后15个氨基酸的突变株1–544)或无融合伙伴的MLL（MLL）单独或与HA标记蛋白AF4、AF5或Dot1l一起表达。左上方的面板描述了在MLL-ENL存在下EAP核心结构的示意图，包括预期的蛋白质-蛋白质相互作用（双头箭头）。如图所示，通过免疫印迹法检测抗MLL沉淀物中HA标记蛋白和内源性CDK9的存在，以及输入样本（inp，5%）。作为对照，MLL-ENL衍生物的成功沉淀通过抗MLL印迹证实。（B） MLL-AF4和MLL-AF5与内源性ENL和CDK9的相互作用。MLL-AF4（MLLAF4758–1210)和MLL-AF5（MLLAF5731–1163)类似于患者来源的融合的蛋白质在293T细胞中表达。注意，如左上和右上面板所示，致白血病MLL-AF4/5融合中缺少N-末端CYCT相互作用域。删除ENL结合域（MLLAF4）的MLL-AF4/5衍生物1023–1210，MLLAF5991–1163)用作控件。免疫印迹法检测内源性ENL和CDK9的共沉淀，如5%输入样品（inp）旁边所示。如上所述控制裂解物中MLL-AF4/AF5的存在。
图4
图4。白血病细胞中MLL融合蛋白与EAP的关联。
（A） 患者衍生SEM细胞中MLL-AF4与内源性ENL和CDK9的免疫共沉淀（IP）。MLL-AF4融合蛋白由来自t（4；11）B淋巴细胞白血病细胞系SEM（上面板）提取物的抗MLL抗体沉淀。为了控制野生型MLL的降水，纳入了不同病因的B-ALL线（REH）（下面板）。与输入样本一起分析降水量，并探测ENL和CDK9。无抗体的模拟沉淀作为附加对照（对照）。请注意，MLL-AF4的大小对应于野生型MLL翻译后裂解后产生的MLL的N端部分。因此，MLL-AF4和MLL-N组合为单波段。在SEM和REH中，CDK9的较长剪接变异体（标有星号[*]）也明显可检测到。（B） 染色质免疫沉淀和HOXA9型在SEM和REH细胞中表达。左图：对人体进行ENL特异性ChIPHOXA9型SEM和REH细胞中的位点。测定了人类五个地点相对于非浓缩输入样品的降水效率HOXA9型通过定量PCR分析SEM（棕色方块）和REH（灰色钻石）中ENL结合染色质的区域。数值绘制为相对富集度，REH结果归一化为一个单位。实验进行了三次，并显示了一个典型示例。给出了三次PCR测量的平均值和标准偏差。右侧面板：HOXA9型表达水平由SEM和REH总RNA的qRT-PCR测定，归一化为肌动蛋白，并以REH作为代表一个单位的校准物绘制。
图5
图5。MLL-ENL结合与霍克斯基因表达。
通过鞭毛-MLL-ENL转化从原代造血细胞获得的小鼠细胞系受到鞭毛特异性ChIP反应。扩增沉淀并将其与商业启动子阵列杂交（ChIP芯片），所述商业启动子阵列位于已知转录起始位点上游2kb和下游0.5kb处。此外，每个草酸铂用校准的引物通过qRT-PCR检测基因。值被归一化为肌动蛋白。结果以热图形式包含在图的上一行（阵列设置/表达水平）。热图图例显示在图的下方。每个彩色编码矩形对应于启动子阵列上表示的2.5 kb基因组序列。第二行显示了草酸铂基因座。全部草酸铂转录本（按比例绘制的绿色箭头）按着丝粒方向转录。蓝色箭头表示与霍克斯基因。如图所示，完整的基因座包含95 kb的基因组DNA。第三行表示标记MLL-ENL绑定的图。木条高度表示原木2相对富集度与对照降水量的比值。条形图颜色表示错误发现概率为<0.05（红色）、<0.1（橙色）和<0.2（黄色）。该图是由两个独立实验编译而成的合成图像。基因组环境霍克萨9microRNA196b基因扩增。箭头表示已知转录起始位点，双箭头表示用于图6所述动力学分析的引物对的位置。未注明日期。===========================================================未检测到。
图6
图6。的动态修改霍克斯MLL融合位点招募EAP。
（A） MLL-ENL条件衍生物转化的细胞形态。在三苯氧胺存在（0天）（+TAM）和退出诱导剂（−TAM）后2周，制备三苯氧酚诱导的MLL-ENL（如[8]所述MLL-ENL-ER）转化的细胞的胞浆样品。幻灯片用May-Grünwald-Giemsa染色，在室温下用尼康数码视距DS-Fi1电子相机拍摄显微照片，相机连接到带有蔡司Neofluar 63×/12.5物镜的蔡司Axioskop，并用CorelDraw软件（Corel）进行处理，无需任何图像增强。（B） ChIP实验。使用（A）中的MLL-ENL-ER细胞记录赖氨酸9（二甲基化，黑线）、赖氨酸27（二甲基化和三甲基化，棕色线）和赖氨酸79（二甲基化，蓝色线）的组蛋白H3甲基化状态以及RNA Pol II的存在（Ser2磷酸化聚合酶，品红色线）。对ChIP样本的第一外显子内的两个位点进行分析霍克萨9以及microRNA196b基因的上游。在第0天（活性MLL-ENL）以及通过提取感应器灭活MLL-ENL后的第3、7、10和14天提取样品。将降水效率归一化为输入样本，并绘制相对于第0天修改水平的值。为了进行绝对比较，还测定了一个非转录的X染色体卫星重复序列的H3K9三甲基化和H3K79二甲基化（如左上方的面板所示）。此外霍克斯9用qRT-PCR定量MLL-ENL-ER停药后的mRNA，并与ChIP结果（红线）一起绘制。该图表显示了三份qPCR评估的平均值和标准偏差，并代表了三个独立实验中的一个典型实验。
图7
图7。MLL-ENL引入的染色质修饰可抵抗分化刺激。
（A） 左面板：由构成性MLL-ENL转化的细胞。在IL-3和G-CSF中培养7天的细胞中gr-1分化标记物的FACS分析。右侧面板：通过去除三苯氧胺（TAM）使MLL-ENL-ER失活前和失活后3天，细胞经条件MLL-ENL-ER转化。gr-1水平。（B） 左面板：qRT-PCR分析霍克萨9在IL-3或G-CSF中培养7 d（轻柱）的构成型MLL-ENL转化的细胞中表达，在去除三苯氧胺之前和之后3 d由条件型MLL-ENL-ER转化的细胞（暗柱，标记为“开”和“关”）中表达。右侧面板：H3K79二甲基化状态对比霍克萨9与以前一样处理的细胞中的位点。数值是一式三份的平均值和标准偏差，实验进行了两次，结果相当。
图8
图8。MLL细胞对CDK抑制的敏感性。
（A） 黄哌啶醇的作用。上图：如图所示，七种MLL细胞系（红线）和四种不同病因的对照白血病细胞系（黑线）接受了递增浓度的黄哌啶醇治疗。通过MTT还原对三份样品的增殖进行光度评估。为了更好地进行比较，550 nm（OD550)在没有抑制剂的情况下，将读数归一化为一个单位。平均值与黄哌啶醇浓度呈半对数关系。为了避免混乱，标准偏差仅适用于MLL和对照细胞系因治疗而出现分歧的药物浓度。（B） ●●●●。阿尔斯特鲍龙的影响。阿尔斯特保龙进行了测试，如（A）所述。（C） flavopiridol和alsterpaulone对原代造血细胞的影响。在补充了IL-3、GM-CSF、IL-6、SCF和指示量的黄哌啶醇或阿尔斯特鲍龙（黑线）的液体培养基中培养供体经5-氟尿嘧啶处理后富含早期前体细胞的三份小鼠骨髓细胞样品。用MTT还原法测量增殖。为了进行比较，用MLL-ENL逆转录前体细胞，并在相同的培养条件下再次测试所得品系的药物敏感性（红线）。给出了三倍的平均值和标准偏差。
图9
图9。MLL融合蛋白转录激活的分子机制。
MLL融合招募EAP核心成分，导致H3K79甲基化以及Pol II CTD丝氨酸2磷酸化。因此，靶基因持续表达，抑制性H3K27和H3K9甲基化没有发生，造血前体细胞被阻止分化。CTD中单个重复单元的氨基酸序列以单字母代码给出。
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