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.2010年2月；332(2):588-98.
doi:10.1124/jpet.109.162099。 Epub 2009年11月18日。

在PNU-120596[1-（5-氯-2,4-二甲氧基苯基）-3-（5-甲基异恶唑-3-基）-尿素]存在下，胆碱的生理浓度可激活含有天然α7的烟碱型乙酰胆碱受体

亚历山大·古塞夫 1, 维克托·乌泰舍夫
附属公司

在PNU-120596[1-（5-氯-2,4-二甲氧基苯基）-3-（5-甲基异恶唑-3-基）-尿素]存在下，胆碱的生理浓度可激活含有天然α7的烟碱型乙酰胆碱受体

亚历山大·古塞夫等。 药理学实验与治疗杂志. 2010年2月.

摘要

PNU-120596[1-（5-氯-2,4-二甲氧基苯基）-3-（5-甲基异恶唑-3-基）-尿素]是α7烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的一种积极变构调节剂，其使用可能有助于加强胆碱能疗法。然而，PNU-120596对胆碱生理浓度激活天然α7-含nAChRs的作用尚不清楚，本研究使用斑贴电生理学和下丘脑薄片中的组胺能结节乳头神经元进行了研究。在PNU-120596存在的情况下，胆碱的阈下（即非活性）生理浓度（约10μM）引发重复的阶梯式全细胞反应，使人联想到单离子通道的开放，而单离子通道被选择性α7 nAChR拮抗剂20 nM甲基甘草碱可逆阻断。胆碱和PNU-120596的作用是协同作用的，因为10至40μM胆碱或1至4μM PNU-1205.96单独使用不会引起反应。在-60 mV电压钳中，10μM胆碱加1μM PNU-120596持续激活含有α7的nAChRs，估计会以8.4 pC/min（约0.14 pA）的速率产生持续的Ca（2+）离子内流。在电流钳中存在PNU-120596时，瞬时阶梯式去极化（约5 mV）增强了神经元的兴奋性和触发电压门控电导；含有alpha7-的nAChR通道的单一开放似乎能使整个神经元暂时去极化并促进自发放电。因此，本研究验证了以下假设：PNU-120596增强了阈下胆碱浓度对天然含有alpha7的nACh受体的影响，允许生理水平的胆碱激活这些受体，并在缺乏外源性烟碱剂的情况下产生全细胞反应。在某些神经系统疾病中，这种激活可能比使用nAChR激动剂治疗更有益、更有效、更安全。

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数字

图1。
图1。
在切片中存在1μM PNU-120596的情况下，对阈下生理浓度的胆碱施加压力。A和B，在最初的一组切片全细胞实验中，单独对电压钳中电压为-60 mV的TM神经元施压10至40μM胆碱（A）和1至4μM PNU-120596（B）并没有引起反应。相比之下，在1μM PNU-120596存在的情况下，C到E压力给药5到20μM胆碱会引起类似于单通道开放的阶梯状电流偏差。膜电压保持在−50 mV.F至H，这些反应被20 nM MLA完全可逆地阻断，这是一种支持α7*nAChRs参与的α7nAChR的选择性拮抗剂。膜电压保持在-50 mV。在这些实验中，ACSF含有20μM加巴静、15μM DNQX、50μM AP5、40μM苦曲霉毒素和0.3μM TTX。
图2。
图2。
胆碱和PNU-120596的协同作用。在电压灯全细胞实验中，对ACSF单独给予10μM胆碱约60分钟（A，顶部追踪）或1μM PNU-120596约55分钟（B，顶部追踪(n个＝9）。相比之下，在持续存在10μM胆碱的情况下添加1μM PNU-120596（A，底线；添加1μM PNU-1205.96后20分钟）或在持续存在1μM的情况下增加10μM的胆碱（B，底线，添加10μM氯化胆碱后22分钟）导致阶梯式电流偏差，这让人联想到施加压力的初始实验中看到的单通道开口（图1）。ACSF灌注速率设置为1 ml/min。记录室的体积为~2ml。这些观察结果证实了胆碱和PNU-120596对天然α7*nAChRs的协同作用。C、 给ACSF注射5μM胆碱和1μM PNU-120596也会产生类似的阶梯式电流偏差。给药1μM PNU-120596后65分钟和给药5μM胆碱后30分钟记录C中显示的电流痕迹。膜电压保持在-60 mV。这些效应对20μM加巴静、15μM DNQX、50μM AP-5、40μM苦毒毒素和0.3μM TTX的ACSF耐受。
图3。
图3。
阻止20 nM MLA。切片中的TM神经元长时间暴露于10μM胆碱和1μM PNU-120596，可诱发电压钳（A）中记录的持续重复阶梯式电流偏差。当从ACSF中去除胆碱长达30分钟时，电流偏差的频率显著但可逆地降低，但PNU-120596仍然存在（B和C），支持胆碱和PNU-12059的协同作用。胆碱和PNU-120596作用的洗脱率在单独的一组实验中进行了研究（图4）。从D到E，电流偏差被20 nM MLA完全可逆地阻断(n个=9），确认参与α7*nAChRs。A到E的所有电流轨迹均来自同一TM神经元。F、 a至E所示实验中使用的实验范式的示意图。将120分钟的记录分为5分钟的间隔，并使用Clampfit-10.1在a至E中规定的不同实验条件下测量这24个间隔中每个间隔中阶梯状电流偏差的净电荷。在F中，A到E中显示的记录道位置用黑色菱形和相应的字母标记：控制1（A）；胆碱洗脱（B）、对照2（C）、+20 nM MLA（D）和MLA洗脱（E）。图表上方的水平条显示了相应阶段（F）的顺序和持续时间。膜电压保持在-60 mV。这些效应对20μM加巴静、15μM DNQX、50μM AP-5、40μM苦毒毒素和0.3μM TTX的ACSF耐受。
图4。
图4。
PNU-120596和胆碱被冲走。为了评估和比较PNU-120596和胆碱的洗脱率，给ACSF注射1μM PNU-1205.96和10μM胆碱长达1 h，然后一次从ACSF中去除一种化合物，并通过测量每分钟记录的电流偏差数来评估洗脱率。膜电压为-60 mV。ACSF含有20μM加巴静、15μM DNQX、50μM AP-5、40μM苦毒毒素和0.3μM TTX。A、 1μM PNU-120596开始冲刷前（1）、10分钟后（2）和20分钟后（3）的一次实验的电流轨迹。在PNU-120596冲洗期间，ACSF中持续存在胆碱（10μM）。β、 PNU-120596冲刷试验分析n个=5个TM神经元。评估电流偏差频率（每分钟事件数），将其归一化为冲刷前1分钟获得的控制值，并绘制成时间函数。用单指数函数拟合数据，并确定时间常数。C、 10μM胆碱开始洗脱前（4）、洗脱后5分钟（5）和洗脱后10分钟（6）的不同实验中的电流轨迹。在胆碱洗脱期间，ACSF中持续存在PNU-120596（1μM）。D、 胆碱洗脱实验分析n个=6 TM神经元与B中描述的神经元相似。时间常数和指数函数的值最适合每个图，如图上方所示，其中x是以分钟为单位的冲刷时间。结果以平均值±标准误差表示。
图5。
图5。
电流偏差的电流-电压关系。根据相应的膜电压绘制了电压钳中在−90 mV和+30 mV之间以30 mV（a）为步长测量的电流偏差振幅，以建立电流-电压关系（B）。在存在内部和外部镁的情况下，所得到的电流-电压关系对于所研究的α7*nAChR来说是典型的2+离子；它在负的膜电压下被向内整流，并且在正的膜电压下没有表现出向外的电流偏差。ACSF含有20μM加巴静、15μM DNQX、50μM AP-5、40μM苦毒毒素和0.3μM TTX。结果显示为平均值±S.D。
图6。
图6。
在10μM胆碱和1μM PNU-120596存在下，电流灯中记录的阶梯状电压去极化。在电压灯（A）和电流灯（B）全细胞配置中均观察到TMα7*nAChR的瞬态阶跃响应。A和B中显示的痕迹代表n个=11个TM神经元，分别取自相同的TM神经元1分钟。电流灯中α7*nAChRs的激活引发了短暂的重复阶梯式去极化：个别事件为～5 mV，同时多个事件为～25 mV。A中的底部记录道和B中的顶部记录道共享这些记录道之间显示的相同时间刻度。垂直刻度条指示20 pA（对于A中显示的电流记录道）或20 mV（对于B中显示的电压记录道）。偶尔，观察到强烈的去极化，导致推测的钙2+尖峰（箭头C）。这些效应对ACSF应用的20μM加巴静、15μM DNQX、50μM AP-5、40μM苦毒毒素和0.3μM TTX具有抗性。内吸管溶液含有CsMeSO3电压灯实验中的膜电压为−60 mV。电压迹线附近的水平条表示膜电压为-60 mV。
图7。
图7。
10μM胆碱加1μM PNU-120596激活TMα7*nAChRs可增强电流钳中TM神经元的自发放电。由于未进行电流注射（即0 pA），TM神经元的自发放电是自然发生的。水平条表示−65 mV。在电流钳中，在没有PNU-120596和胆碱的情况下，TM神经元表现出规则的自发放电模式，平均频率为2.1±0.5 Hz(n个=5）（A）。在这些对照实验中，当通过注入小电流（B）将膜电压超极化至−65 mV时，未观察到阶梯式去极化(n个=5）（B）。A和B中的记录分别取自同一TM神经元1分钟。在n个=7个实验，在给予10μM胆碱和1μM PNU-120596（C）后，在电压灯下观察到TM nAChRs持续重复激活后，使用相同的TM神经元（D）进行电流灯记录。在电流钳中，TMα7*nAChRs的激活导致TM神经元自发放电频率的短暂重复增加（C和D，填充箭头）。C和D中显示的痕迹是从相同的TM神经元中获得的，间隔1分钟。带边框的插图说明了记录的一部分，其中包含一个具有较高时间分辨率的瞬态激励。E、 对D中所示电压轨迹的分析。事件频率的直方图（实线，箱大小=1s）与瞬时频率的散点图重叠。D和E共享相同的时间尺度。左坐标和右坐标分别对应于事件频率直方图和瞬时频率。在n个=7个TM神经元（见正文）。在10μM胆碱和1μM PNU-120596的存在下，α7*nAChRs介导的瞬时去极化使TM自发放电（黑点）的瞬时频率从～1.61增加（仅低频模式；n个=7，D-E，开放箭头）至～2.67 Hz（仅高频模式；n个= 7; D-E，填充箭头），统计上显著增加66%(第页=0.002，成对t吨测试，n个= 7). TM自发放电的平均事件频率（定义为长时间间隔（>1分钟）测量的动作电位的平均频率）也从2.03±0.80 Hz增加(n个= 6; 仅低频模式；D–E）至2.74±0.83 Hz(n个= 6; 低频和高频模式；D-E，开放箭头和填充箭头），统计显著增加35%(第页< 0.02; 配对检验；n个= 6). 这些效应对ACSF应用的20μM加巴静、15μM DNQX、50μM AP-5和40μM苦毒毒素具有抗性。这些实验中没有使用TTX。内吸管溶液含有葡萄糖酸钾。低频模式的频率（2.03±0.8 Hz，n个= 6; D-E，开放箭头）和控制自发放电（2.1±0.5 Hz，n个= 5; A） 被发现在统计上相似(第页> 0.86).
图8。
图8。
电流钳中单个阶梯状去极化的影响。A、 当在频率增加的延长间隔（开放三角形和填充三角形之间的间隔）内，在记录的TM神经元中注入超极化电流（～−40 pA）（注入时间以*标记）时，会导致自发放电停止，允许检测潜在阶梯状去极化的最后部分(n个= 3; 实心三角形）。因此，可以观察到长时间的去极化，即去极化开始时的自发放电增加（开放三角形）和去极化结束时的去极化步骤（填充三角形）。在两条虚线之间可以看到随后的阶梯状去极化（参见插图）。插图以更高的分辨率演示了此过渡过程。在这些实验中，ACSF含有20μM加巴静、15μM DNQX、50μM AP-5和40μM苦毒毒素。内溶液为葡萄糖酸钾溶液（参见材料和方法). B、 为了可视化个别去极化，向记录的神经元注入一个小的连续超极化电流（−5 pA），导致自发放电停止。在这些静默条件下，短暂去极化触发短串动作电位（B，开放箭头）。然而，偶尔去极化不会触发动作电位，或每次去极化只触发一个动作电位（B，填充箭头）。水平条表示−65 mV的薄膜电压。
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