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.2009年12月；119(12):3817-29.
doi:10.1172/JCI39054。 Epub 2009年11月16日。

MAPK磷酸酶-1促进小鼠肥胖相关氧化性肌纤维的丢失

瑞秋·J·罗斯 1, 安妮·M·勒, 张磊（Lei Zhang）, 马里奥·卡恩, 瓦尔曼·T·塞缪尔, 杰拉尔德·舒尔曼, 安东·本内特
附属公司

MAPK磷酸酶-1促进小鼠肥胖相关氧化肌纤维的损失

雷切尔·J·罗斯等。 临床研究杂志. 2009年12月.

摘要

氧化性肌纤维，也称为慢开关肌纤维，有助于维持哺乳动物的新陈代谢健康，有人提出数量减少与肥胖风险增加相关。转录辅激活子PPARgamma辅激活子1alpha（PGC-1alha）在维持骨骼肌氧化性肌纤维水平方面起着核心作用。事实上，PGC-1α表达的缺失与肥胖小鼠骨骼肌中氧化肌纤维比例的降低有关。MAPK磷酸酶-1（MKP-1）由MKP-1编码，这是一种对核内MAPK进行去磷酸化的应激反应早期基因。之前我们发现，缺乏MKP-1的小鼠会增加能量消耗，并对饮食诱导的肥胖具有抵抗力。我们在小鼠中发现，过量的膳食脂肪诱导骨骼肌中MKP-1过度表达，这导致p38 MAPK介导的PGC-1alpha在促进其稳定性的位点上磷酸化降低。与此相一致，MKP-1缺陷小鼠在骨骼肌中表达的PGC-1α水平高于野生型小鼠，并且在喂食高脂肪饮食时，对氧化性肌纤维的丢失难以耐受。总之，这些数据证明了MKP-1作为骨骼肌肌纤维组成调节器的重要作用，并表明MKP-1在代谢综合征中的潜在作用。

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数字

图1
图1。对饮食诱导肥胖的抵抗力和增加的能量消耗磷酸酯酶-1–/–老鼠。
(A类)129/J型磷酸酯酶-1+/–小鼠与野生型C57BL6/J小鼠回交8代。断奶时回交磷酸酯酶-1+/+和磷酸酯酶-1–/–将小鼠置于HFD上，并在16周内每周监测体重。数据为平均值±SEM(n个=每个时间点8–16）。(B)磷酸酯酶-1+/+和磷酸酯酶-1–/–喂食HFD 16周后，对小鼠进行质子磁共振波谱分析(n个= 6–8). 数据为平均值±SEM(C类–F类)磷酸酯酶-1+/+和磷酸酯酶-1–/–喂食HFD 16周后，对小鼠进行开路热量测定(C类)耗氧量(D类)能源消耗(E类)食品消费，以及(F类)记录运动活动。中的数据C类–F类为平均值±SEM(n个= 6–8). *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.005,#P（P）<0.0005与磷酸酯酶-1+/+.
图2
图2。HFD和FAs诱导骨骼肌中MKP-1过度表达。
(A类)从喂食食物或HFD指定时间的小鼠中分离出四头肌。对MKP-1进行Northern杂交，并将其归一化为GAPDH。所示为标准化磷酸酯酶-1HFD 0-4周的mRNA水平(n个=3–9）或16周喂食或HFD的小鼠(n个= 6–7). 后者显示了具有代表性的Northern blot图像。数据为平均值±SEM(B)用MKP-1启动子-荧光素酶（-1.4kb）和TK雷尼拉转染C2C12成肌细胞，并用500μM棕榈酸（C16:0）、棕榈油酸（C16:1n7）、二十碳五烯酸（C20:5n3）和樟柳霉素刺激16小时。数据是相对于载体对照，归一化到雷尼拉的萤光素酶的平均值±SEM(n个= 3–7). (C类)用500μM棕榈酸酯刺激C2C12成肌细胞指定时间，获取RNA磷酸酯酶-1通过定量实时RT-PCR测量mRNA水平，并将其归一化为18秒数据为3-7个实验的平均值±SEM。(D类)C2C12成肌细胞用指示的MAPK抑制剂预处理，并用载体或500μM棕榈酸酯刺激30分钟。MKP-1水平测定如下C类数据为3-7个实验的平均值±SEM。(E类)用500μM棕榈酸酯刺激C2C12成肌细胞达到指定时间，并进行MKP-1或Erk1/2的免疫印迹。免疫印迹是3个独立实验的代表*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.005,#P（P）<0.0005与各自的控制或括号中另有指示。
图3
图3。MKP-1介导肥胖患者氧化性肌纤维丢失。
(A类)NADH脱氢酶染色和定量(n个=5–6）来自HFD喂养的TA肌肉磷酸酯酶-1+/+和磷酸酯酶-1–/–老鼠。(B)琥珀酸脱氢酶染色和定量(n个=3）喂食HFD的TA肌肉磷酸酯酶-1+/+和磷酸酯酶-1–/–老鼠。(C类)细胞色素氧化酶染色和定量(n个=3–5）来自HFD喂养的TA肌肉磷酸酯酶-1+/+和磷酸酯酶-1–/–老鼠。原始放大倍数，×100。数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.005.
图4
图4。MKP-1介导肥胖中的糖酵解纤维类型转换。
(A类)HFD喂养的TA肌肉的MHCI、MHCIIA、MHCIIX和MHCIIB免疫组织化学染色的显微照片磷酸酯酶-1+/+和磷酸酯酶-1–/–老鼠。原始放大倍数，×100。(B)染色纤维类型百分比(n个= 4–8). 数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.005.
图5
图5。MKP-1负调节PGC-1α辅活化因子活性。
(A类)将PGC-1α-GAL4、5xGAL4-荧光素酶、升高浓度的MKP-1和TK-Renilla转染到C2C12成肌细胞中。在测量荧光素酶和Renilla之前，用10 ng/ml TNF-α刺激成肌细胞24小时。数据是来自4个单独实验的平均值±SEM归一化荧光素酶/Renilla值。(B)左图：PGC-1α-GAL4、5xGAL4-荧光素酶和TK-Renilla与50 nM MKP-1或非靶向（NT）siRNA一起转染到C2C12成肌细胞中。在测量荧光素瘤酶和肾素之前，成肌细胞处于饥饿状态，未经刺激或用10 ng/ml TNF-α刺激24小时。数据是来自3个单独实验的平均值±SEM归一化荧光素酶/Renilla。右图：用50 nM MKP-1或非靶向siRNA转染C2C12成肌细胞；24小时后，对细胞进行MKP-1或SHP-2免疫印迹，作为负荷对照。Lanes在同一凝胶上运行，但不连续（白线）。(C类)pGL3-PGC-1α启动子-荧光素酶（-2.0 kb）和TK-雷尼拉在没有或存在MKP-1和MKK6EE的情况下转染到C2C12成肌细胞。48小时后测量荧光素酶和Renilla。数据是来自4个单独实验的平均值±SEM归一化荧光素酶/Renilla值。(D类)第1a部分年龄匹配的TA肌肉中的mRNA水平磷酸酯酶-1+/+和磷酸酯酶-1–/–通过定量实时RT-PCR测定，喂食16周或HFD后的小鼠。数据均数±SEM标准化为18秒信使核糖核酸(n个= 5–8). *P（P）< 0.05; **P（P）< 0.005.
图6
图6。MKP-1拮抗PGC-1α磷酸化和蛋白质稳定性。
(A类)将标记有标志的PGC-1α、MKK6EE、MKK7DD和MKP-1（10μg）转染到C2C12成肌细胞中。24小时后裂解成肌细胞，并用PGC-1α、MKP-1、磷酸化p38 MAPK、p38 MAPK、磷酸化JNK和JNK抗体进行免疫印迹。(B)Flag标记的PGC-1α与非靶向siRNA或MKP-1 siRNA一起转染到C2C12成肌细胞中，如图5B所示，并用35进行S蛋氨酸/半胱氨酸检测。密度分析被量化为相对于时间0的PGC-1α剩余量。平均值t吨1/2根据3个独立实验（非靶向siRNA，56.7分钟；MKP-1 siRNA，83.5分钟；P（P）< 0.05). 数据为平均值±SEM(C类)用MKK6EE将标记的PGC-1α以及标记的PGC-1αSer265A和Thr298A突变体转染到C2C12成肌细胞中。裂解成肌细胞，用抗Flag抗体免疫沉淀PGC-1α，并用总PGC-1β、磷酸化-Ser265 PGC-1γ或磷酸化-Thr298 PGC-1δ抗体免疫印迹。Lanes在同一凝胶上运行，但不连续（白线）。(D类)将Flag-PGC-1α、MKK6EE和MKP-1（2μg）转染到C2C12成肌细胞中。裂解成肌细胞，用抗Flag抗体免疫沉淀PGC-1α，并进行免疫印迹，如C类图中显示了三个独立实验中归一化为总PGC-1α的磷酸化-Ser265 PGC-1和磷酸化-Thr298 PGC-1的密度测量值。数据为平均值±SEM(E类)将标记的PGC-1α与50 nM非靶向或MKP-1 siRNA一起转染到C2C12成肌细胞中。成肌细胞在用10 ng/ml TNF-α和2 ng/ml IL-1β刺激前饥饿2小时。裂解成肌细胞，用抗Flag抗体免疫沉淀PGC-1α，并进行免疫印迹，如C类.
图7
图7。增强PGC-1α表达和磷酸化磷酸酯酶-1–/–老鼠。
(A类)年龄匹配的TA肌肉核提取物磷酸酯酶-1+/+和磷酸酯酶-1–/–喂食食物或HFD 16周的小鼠进行磷酸化p38或p38 MAPK免疫印迹。还显示了磷–p38 MAPK水平归一化为总p38 MAPK的密度测量。数据为平均值±SEM(n个= 8–9). (B)核提取物，如A类对磷酸化Ser265 PGC-1α进行免疫印迹。Lanes在同一凝胶上运行，但不连续（白线）。还显示了标准化为Lamin-β1的磷酸化Ser265 PGC-1α表达的密度测量。数据为平均值±SEM(n个=4–9）。(C类)TA肌肉从磷酸酯酶-1+/+和磷酸酯酶-1–/–喂食食物或HFD的小鼠16周。肌肉裂解物用PGC-1α抗体进行免疫印迹，PGC-1β表达的密度测量值归一化为p38 MAPK。数据为平均值±SEM(n个= 6). (D类)在HFD条件下，FAs暴露增加MKP-1表达，导致核p38 MAPK失活。p38 MAPK介导的PGC-1α磷酸化降低了PGC-1的表达。骨骼肌PGC-1α功能受损促进氧化性肌纤维成分的丢失。‡P（P）= 0.05; *P（P）< 0.05; **P（P）< 0.005.
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