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.2010年1月;221(1):166-74.
doi:10.1016/j.expneuro.2009.10.019。 Epub 2009年10月31日。

Sigma受体配体4-苯基-1-(4-苯基丁基)-哌啶调节神经元一氧化氮合酶/突触后密度-95偶联机制并保护纹状体神经元免受新生儿缺血性变性

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Sigma受体配体4-苯基-1-(4-苯基丁基)-哌啶调节神经元一氧化氮合酶/突触后密度-95偶联机制并保护纹状体神经元免受新生儿缺血性变性

曾金阳等。 实验神经学. 2010年1月.

摘要

在成人中风模型中,4-苯基-1-(4-苯基丁基)哌啶(PPBP)是一种sigma受体激动剂,可减弱神经元一氧化氮合酶(nNOS)的活性,减缓缺血诱导的一氧化氮生成,并提供神经保护。在这里,我们测试了PPBP减轻新生仔猪整体缺氧缺血性(H-I)模型中神经元损伤的假设。复苏后,用生理盐水或两种剂量的PPBP治疗缺氧后窒息性心脏停搏的仔猪。纹状体神经元中发现了Sigma-1受体。PPBP剂量依赖性地保护H-I恢复后4天壳核中的神经元。恢复后3小时壳核提取物的免疫印迹显示,PPBP减少了H-I诱导的膜部分nNOS的募集,并减少了nNOS与NMDA受体NR2亚单位的关联。后一种效应与nNOS与突触后密度-95(PSD-95)耦合的变化有关,但与NR2-PSD-95相互作用无关。此外,PPBP抑制了膜组分中NOS的活性,并减少了H-I对蛋白质和核酸的硝化和氧化损伤。这些发现表明,PPBP在新生儿H-I大动物模型中保护纹状体神经元,并且这种保护与nNOS与PSD-95的耦合减少有关。

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图1
图1
PPBP对缺氧缺血性(H-I)仔猪神经损伤和神经功能缺损的影响。将暴露于H-I或假手术的仔猪静脉注射生理盐水、低剂量PPBP(PPBP-low)或高剂量PPBP。(A) H&E染色切片的代表性照片显示,低剂量和高剂量PPBP可减轻恢复4天时壳核的缺血性神经元损伤。箭头指向典型的缺血损伤神经元,箭头表示正常神经元。标尺=40µm,插入件中的标尺=8µm。(B) Western blot和双免疫荧光结果显示,sigma-1受体存在于猪纹状体中,主要定位于神经元。Ponceau S用作装载控制。比例尺=8µm。(C) 存活壳核神经元的定量结果表示为假手术+生理盐水组平均值的百分比。(D) 4天恢复期间的神经功能评分。数据表示平均值±标准差(每组4至10)*P(P)与假手术+生理盐水组相比,<0.05#P(P)与H–I+盐水组相比<0.05;方差分析,然后是学生-纽曼-凯尔斯测试。
图2
图2
Western blot分析显示PPBP对恢复后3 h壳核膜富集部分Ser896-和Ser897-磷酸化NR1和总NR1水平的影响(每组4至6个)。突触体素(Syn)用作负荷控制。将数据(平均值±标准差)标准化为假手术+生理盐水值*P(P)与假手术+生理盐水组相比,<0.05#P(P)与H–I+盐水组相比<0.05;单向方差分析,然后进行Student-Newman-Keuls测试。
图3
图3
PPBP处理对恢复后3小时(每组4至6只)断奶仔猪或H–I仔猪壳核中nNOS表达和活性的影响。(A) nNOS在富含细胞液(cyto)的壳核部分中的表达高于富含膜(mem)部分。Ponceau S用作装载控制。H–I增加了膜富集组分(B)中的nNOS水平,但没有增加胞质溶胶富集组分(C)中的nNOS水平。PPBP减轻了膜富集组分中H–I增强的nNOS表达。NR2A/2B抗体免疫沉淀导致nNOS在富含膜的壳核部分(D)和前额叶皮层(E)共沉淀。然而,H–I仅在壳核中增加了nNOS和NR2之间的相互作用[可见光密度(OD)比的增加](D)。通过PPBP治疗,增加值恢复到控制水平。(F) PPBP处理减轻了壳核膜富集部分H–I诱导的NOS活性。所有数据均显示为平均值±标准差,标准化为假手术+生理盐水值*P(P)与假手术+生理盐水组相比,<0.05#P(P)与HI+盐水组相比<0.05;单因素方差分析后进行Student Newman-Keuls检验。
图4
图4
H-I和PPBP处理对NR2与nNOS关联的影响涉及nNOS与PSD-95耦合的变化,而非PSD-95与NR2耦合的变化。壳核膜富集组分的免疫沉淀(一个)或前额叶皮层(B类)用抗PSD-95抗体恢复后3小时,nNOS和NR2共沉淀。H–I仅在壳核中增加了nNOS和PSD-95之间的相互作用[可见光密度(OD)比的增加]。通过PPBP治疗,这种增加恢复到控制水平。(C类)Western blot分析表明,H–I在恢复后3 H诱导膜富集组分中的nNOS Ser847磷酸化;PPBP治疗阻止了诱导。H–I–诱导的磷酸化Ser847的增加与总膜nNOS的增加成比例,导致磷酸化蛋白的相对量没有变化。所有数据均显示为平均值±标准差,标准化为假手术+生理盐水值*P(P)与假手术+生理盐水组相比,<0.05#P(P)与H–I+盐水组相比<0.05;单向方差分析,然后进行Student-Newman-Keuls测试。
图5
图5
PPBP治疗可在恢复后3小时降低H–I诱导的壳核氧化和硝化应激。假手术或h-I后恢复3 h时,仔猪壳核8-羟基-2-脱氧鸟苷(OHdG)/8-羟基鸟苷(OHG)(A)和8-硝基鸟苷(Nitro-G)(B)免疫组织化学染色的代表性切片。假手术仔猪的细胞体染色微弱,而在胞质溶胶和细胞核中都可以观察到信号升高。插图:细胞核中具有代表性的硝基-G信号。比例尺=50µm;插入比例尺=10µm。(C) 恢复后3 H,H–I增加壳核OHdG/OHG和Nitro-G阳性细胞的光密度(OD);通过PPBP治疗,两者均被减弱(每组85至150个细胞)。(D) Western blot分析表明,PPBP降低了恢复后3 H断奶仔猪和H–I仔猪壳核多个蛋白带上H–I诱导的3-硝基酪氨酸免疫反应性。所有数据均显示为平均值±标准差*P(P)与假手术+生理盐水组相比,<0.05#P(P)与H–I+生理盐水组相比,<0.05;单向方差分析,然后进行Student-Newman-Keuls测试。

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