Activated BRAF induces gliomas in mice when combined with Ink4a/Arf loss or Akt activation

doi:10.1038/onc.2009.333

.2010年1月21日；29(3):335-44.

doi:10.1038/onc.2009.333。 Epub 2009年10月26日。

激活的BRAF与Ink4a/Arf缺失或Akt激活结合时诱导小鼠胶质瘤

J P罗宾逊¹, M W Van Brocklin先生, A R吉尔伯特, D L西格诺雷利, S布兰德纳, S L霍尔曼

附属公司

PMID： 19855433
预防性维修识别码：项目经理4109991
内政部： 10.1038/2009年1月333日

激活的BRAF与Ink4a/Arf缺失或Akt激活结合时诱导小鼠胶质瘤

J P罗宾逊等。癌基因. 2010.

.2010年1月21日；29(3):335-44.

doi:10.1038/onc.2009.333。 Epub 2009年10月26日。

作者

J P罗宾逊¹, M W Van Brocklin先生, A R吉尔伯特, D L西格诺雷利, S布兰德纳, S L霍尔曼

附属

¹美国内华达州拉斯维加斯内华达癌症研究所药物开发部，内华达89135。

PMID： 19855433
预防性维修识别码：项目经理4109991
内政部： 10.1038/2009年1月333日

摘要

受体酪氨酸激酶（RTK）生长因子受体（表皮生长因子受体、血小板衍生生长因子受体、MET和ERBB2）的突变，导致RAS/RAF/MEK/ERK丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径和PI（3）K/Akt途径的下游激活，几乎在所有高级别胶质瘤中都发现，MAPK信号对胶质瘤的持续维持是必要的。此外，BRAF在大多数低度恶性胶质瘤中发生突变，在大多数高级胶质瘤中其表达和活性显著增加。尽管RTKs和RAS信号在胶质瘤发展中的重要性已被证明，但BRAF的作用尚待确定。我们使用逆转录病毒复制能力强的禽白血病病毒长末端重复序列、剪接受体（RCAS）/TVA系统，在体内将编码激活形式的BRAF、KRas、Akt和Cre的基因转移到Ink4a/Arf（lox/lox）小鼠的巢蛋白表达神经前体细胞中，评估了激活的BRAF在胶质瘤形成中的作用。尽管激活的BRAF单独表达不足以促进肿瘤发生，但激活的BRAF与Akt或BRAF与Ink4a/Arf丢失的结合正在发生改变。有趣的是，激活的BRAF生成的胶质瘤具有与Akt背景下激活的KRas相似的特征，但不具有Ink4a/Arf丢失的特征。我们的研究表明，BRAF激活和信号转导在胶质瘤发展中发挥作用，并作为胶质瘤治疗的潜在靶点。

PubMed免责声明

数字

**图1。KRas公司^G12D系列和BRAF^V600E型与激活的Akt合作或*墨水4a/Arf*N-TVA小鼠诱发胶质瘤的损失**
（a）体外GFP在N-TVA星形胶质细胞中的表达。培养物中N-TVA阳性和阴性（对照）细胞的RCASBP（A）GFP感染证实GFP稳定且靶向地传递到N-TVA表达细胞中。**（b）基因表达的Western blot分析。**用RCASBP（A）感染培养的N-TVA阳性永生化星形胶质细胞*GFP公司*（车道1），RCASBP（A）*阿克特*（车道2），RCASBP（A）*KRas公司^G12D系列*（车道3），RCASBP（A）*BRAF公司^V600E型*（车道4），RCASBP（A）*BRAF公司^V600E型*和RCASBP（A）*阿克特*（车道5），或RCASBP（A）*阿克特*和RCASBP（A）*KRas公司^G12D系列*（第6车道）。将裂解物在4-20%Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到硝化纤维素上，并用针对V5（BRAF）、HA（Akt）、泛RAS（KRas）、磷酸化Erk（P-Erk）或总Erk（Erk）的抗体探测，如图所示。用抗α-微管蛋白抗体（底部）对膜进行重新保护，以确保负载均匀。Ras印迹显示内源性Ras（下带）和病毒传递的KRas（上带）。由于FLAG表位标签，病毒传递的KRas分子量较高。**（c） Kaplan-Meier百分比生存曲线。**N-TVA；*墨水4a/Arf^{液氧/液氧}*小鼠出生时注射了指示的病毒。使用Kaplan-Meier生存率估计值的log-rank检验分析截尾生存率数据。注射BRAF的小鼠未观察到肿瘤^V600E型或单独使用Cren个=36（实心黑线），之前已经证明注射KRas的小鼠没有肿瘤形成^G12D系列或仅Akt（荷兰等。, 2000). KRas之间的生存率没有显著差异^G12D系列+阿克特n个=50（红线）BRAF^V600E型+Cre公司n个=26（蓝线）或BRAF^V600E型+阿克特n个=28（绿线）。KRas之间的存活率存在显著差异^G12D系列+Cre公司n个=17（黑色虚线）和所有其他条件，*P（P）*< 3 × 10⁻⁷.

**图2。KRas诱发的典型肿瘤^G12D系列或BRAF^V600E型与激活的Akt或Cre合作*（Ink4a/Arf*损失）**
N-TVA诱导胶质瘤的组织学比较；*墨水4a/Arf^{液氧/液氧}*小鼠注射**（a-b）**BRAF公司^V600E型+阿克特，**（c-d）**布拉夫^V600E型+Cre、，**（e-f）**KRas公司^G12D系列+Akt和**（g-h）**KRas公司^G12D系列+创建。虽然CNS边界很明确(**g-h（克-小时）**)肿瘤没有浸润性，侵犯通过蛛网膜下腔和Virchow-Robin血管周围间隙进行（箭头，小时). 比例尺代表500μm。

**图3。N-TVA胶质瘤基因表达的免疫组化证实；*墨水4a/Arf^{液氧/液氧}*老鼠**
**（a）**BRAF上V5表位标签的IHC^V600E型BRAF诱导的胶质瘤^V600E型+创建。**（b）**BRAF上V5表位标签的IHC^V600E型BRAF诱导的胶质瘤^V600E型+阿克特。**（c）**KRas诱导胶质瘤中KRas上FLAG表位标签的IHC^G12D系列+阿克特。**（d）**KRas上FLAG表位标签的IHC^G12D系列KRas诱导的胶质瘤^G12D系列+创建。**（e）**KRas诱导胶质瘤Akt上HA表位标签的IHC^G12D系列+阿克特。**（f）**BRAF诱导的胶质瘤中Akt上HA表位标签的IHC^V600E型+AKT公司。p19的IHC表示p19在**（g）**KRas公司^G12D系列,**（f）**BRAF公司^V600E型+Cre诱导的胶质瘤。比例尺代表200μm。

**图4。KRas诱导胶质瘤中星形胶质细胞和少突胶质细胞标记物的表达^G12D系列**
**（a-b）**与IHC分析进行组织学比较的相应H&E切片。**（c-d）**星形胶质细胞标志物GFAP的表达。**（e-f）**少突胶质细胞标记物Olig2的表达。**（g-h）**神经祖细胞标记物Nestin的表达。比例尺代表200μm。

**图5。BRAF诱导胶质瘤中星形胶质细胞和少突胶质细胞标记物的表达^V600E型**
**（I-II）**BRAF公司^V600E型活化的Akt诱导的胶质瘤在表达和外观上具有高度的多形性，因此突出显示了两个示例，以与**（三至四）**BRAF的高度单态性^V600E型脑胶质瘤*墨水4a/Arf*损失。**（a-b和i-j）**与IHC分析进行组织学比较的相应H&E切片。**（c-f和k-l）**星形胶质细胞标志物GFAP的表达。**（e-f和m-n）**少突胶质细胞标记物Olig2的表达。**（g-h和o-p）**神经祖细胞标记物Nestin的表达。比例尺代表200μm。

**图6。所有胶质瘤均显示MAPK通路激活和高水平增殖**
**（A-D）**MAPK激活的确认。IHC检测P-Erk证实了任一KRas诱导的所有胶质瘤中MAPK的激活^G12D系列或BRAF^V600E型.（e-h）肿瘤血管分析。内皮细胞标志物内粘蛋白的IHC突出了Akt/KRas高度异常的血管系统^G12D系列胶质瘤与其他肿瘤标本的比较。**（i-l）**有丝分裂活性评估。细胞分裂标记Ki67的IHC表明所有肿瘤都是高度增殖的。比例尺代表200μm。

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1. Bromberg-White JL、Webb CP、Patacsil VS、Miranti CK、Williams BO、Holmen SL。使用可复制的禽逆转录病毒载体传递短发夹RNA序列。《维罗尔杂志》。2004;78:4914–6.-项目管理咨询公司-公共医学

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[8] Basto D、Trovisco V、Lopes JM、Martins A、Pardal F、Soares P等。人类胶质瘤中B-RAF基因的突变分析。神经病理学学报。2005;109:207–10.-公共医学

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