Lymphocytic infiltration leads to degradation of lacrimal gland extracellular matrix structures in NOD mice exhibiting a Sjögren's syndrome-like exocrinopathy

doi:10.1016/j.exer.2009.10.008

.2010年2月；90(2):223-37.

doi:10.1016/j.exer.2009.10.008。 Epub 2009年10月21日。

在表现出Sjögren综合征样外分泌病的NOD小鼠中，淋巴细胞浸润导致泪腺细胞外基质结构降解

卡贾·申克-莱兰¹, 谢建松, 马蒂亚斯·马格努森, 叶卡捷琳尼·安吉利斯, 李晓东, 吴开进, 迪特尔·莱因哈特, W罗伯·麦克莱兰, 莎拉·F·哈姆-阿尔瓦雷斯

附属公司

PMID： 19852957
预防性维修识别码： PMC2821966型
内政部： 2016年10月10日/j.exer.2009年10月08日

在表现出Sjögren综合征样外分泌病的NOD小鼠中，淋巴细胞浸润导致泪腺细胞外基质结构降解

卡贾·申克-莱兰等。实验眼睛分辨率. 2010年2月.

.2010年2月；90(2):223-37.

doi:10.1016/j.exer.2009.10.008。 Epub 2009年10月21日。

作者

卡贾·申克-莱兰¹, 谢建松, 马蒂亚斯·马格努森, 叶卡捷琳尼·安吉利斯, 李晓东, 吴开进, 迪特尔·莱因哈特, W Robb Maclellan先生, 莎拉·哈姆·阿尔瓦雷斯

附属

¹加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院心血管研究实验室医学/心脏病学系，加利福尼亚州洛杉矶市，邮编90095-1760。kschenkelayland@mednet.ucla.edu

PMID： 19852957
预防性维修识别码： PMC2821966型
内政部： 2016年10月10日/j.exer.2009年10月08日

摘要

我们以前曾报道过男性非肥胖糖尿病（NOD）小鼠的泪腺（LG），这是一种建立的自身免疫炎症LG疾病小鼠模型，在患有Sjögren综合征（SjS）的患者中表现出人类LG的许多特征，表现出细胞外基质（ECM）的显著降解基质金属蛋白酶（MMPs）的结构和表达增加。本研究的目的是扩大已鉴定蛋白酶的谱，阐明其可能的来源，并确定这些变化对疾病发病机制的贡献。我们深入研究了男性NOD小鼠LG在发病（6周）和晚期疾病（18周）时，相对于年龄匹配的男性NODscid、一种严重免疫受损的同源株和健康BALB/c小鼠的LG，ECM结构和ECM蛋白酶表达的变化。使用常规组织学、免疫组织化学、Western Blot和基因表达分析新的多光子成像技术检查LG组织。我们使用流式细胞术进一步表征了每种条件下浸润免疫细胞的特征。我们的结果表明，6周龄时的初始浸润细胞负责增加MMP和组织蛋白酶H的表达，从而启动NOD小鼠LG ECM的降解。更重要的是，NODscid小鼠表现出正常的LG ECM结构，表明NOD小鼠LG中的淋巴细胞负责LG ECM的降解。LG ECM结构的疾病相关重塑可能在改变腺泡信号环境、破坏细胞内的信号支架（这些支架是动员细胞外转运机制所必需的）方面发挥关键作用，最终导致SjS患者LG功能的丧失。

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数字

图1
18周龄BALB/c LGs的免疫组织化学染色(**A、 D、G、J、M、P、S**)，点头(**B、 E、H、K、N、Q、T**)和NOD-*科学情报部*(**C、 F、I、L、O、R、U**)小鼠发现NOD-LG组织中有大量炎症浸润，主要位于腺泡（a）、导管（d）和血管（bv）周围，与ECM蛋白的空间降解有关。图像显示F-actin染色(红色)以及阳性染色(绿色)用于：I型胶原蛋白(**A–C**)，类型III(**D–F型**)和IV型(**G–I型**); 层粘连蛋白1(**J–L型**); HS-GAG公司(**M–O型**); 云芝属植物(**P–R（P–R）**); 和tenascin C(**S–U**). 进行DAPI训练以显示细胞核(蓝色). 比例尺等于50μm。

图2
18周龄BALB/c LG组织的免疫荧光图像(**A、 D、G、J、M**)，节点(**B、 E、H、K、N**)和NOD-*科学情报部*(**C、 F、I、L、O**)F-actin染色小鼠(红色)以及阳性染色(绿色)用于：原弹性蛋白(**A–C**); 纤维蛋白1(**D–F型**); 原纤维蛋白2(**G–I型**); 纤维蛋白5(**J–L型**); 和纤维连接蛋白(**M–O型**). 细胞核用DAPI染色(蓝色). Acini（a）、导管（d）和血管（bv）。比例尺等于50μm。

图3
(A类)对于半定量分析，评估包括BALB/c LG在内的所有组织的荧光强度(**a–d**). 对于每种抗体，如I型胶原，荧光强度以I为单位进行测量。）感兴趣的总细胞外区域（ROI1）(b条; （如红色区域所示），II。）感兴趣的组织结构特定区域（ROI2；腺泡（a）、导管（d）、血管（bv））(**c（c）**; 红色轮廓区域）以及III.）感兴趣的核区域（ROI3）(d日; 用DAPI染色定义。(B类)NOD LG组织切片的免疫荧光染色显示LG ECM蛋白（如I型胶原）严重降解(一(绿色)和b条)主要见于炎症浸润水平升高的区域(一（DAPI–细胞核染色蓝色)和d日)，由图像中的红线区域表示b条（请注意绿色箭头）。F-actin染色如图所示一(红色)和图像**c（c）**. (C类)图表描述了使用半定量免疫荧光强度分析测定的细胞外与细胞核比率(**P（P）*与BALB/c和NOD相比<0.05-*科学情报部*LG）。

图4
(A类)18周龄BALB/c、NOD和NOD新鲜解剖未处理LG的多光子诱导自体荧光图像-*科学情报部*使用两个740nm波长的小鼠(**a、 c、e**; 主要是细胞和弹性纤维）和860 nm(**b、 d、e**; 胶原蛋白纤维）。注意，NOD LG组织中几乎没有细胞(**c（c）**)只有减少的胶原蛋白(d日)可检测到自体荧光。比例尺等于40μm。(B类)这些图表示相应的lambda叠加图像（BALB/c）中显示的胶原结构的峰值（ROI 1，红色）和平均（ROI 2，绿色）SHG强度=一; NOD（诺德）=b条，NODscid公司=**c（c）**)，由红十字（ROI 1）或绿框（ROI 2）表示。注意异常、非常微弱的NOD LG SHG信号(b条)表明大多数胶原纤维的超微结构发生了实质性的解体。

图5
基于归一化的基因表达分析*Gapdh公司*作为“家政基因”，年龄匹配6岁(A类)和18(B类)周龄NOD LG与来自BALB/c和NOD的LG组织的比较-*科学情报部*小鼠表现出I型、III型和IV型胶原、层粘连蛋白1和云芝聚糖的表达显著下调，以及NOD LG中tenascin C的表达增加。纤维蛋白1和2、纤维蛋白5以及纤维连接蛋白的表达没有明显变化(**P（P）*与BALB/c和NOD相比<0.05-*科学情报部*LG）。

图6
年龄匹配6的基因表达分析(A类)和18(B类)周龄NOD LG与来自BALB/c和NOD的LG组织的比较-*科学情报部*小鼠，正常化*拉布3d*(**P（P）*与BALB/c和NOD相比<0.05-*科学情报部*LG）。概述*拉布3d*基因表达模式（半定量RT-PCR）显示了6个(A类)和18周(B类)旧BALB/c、NOD和NOD-*科学情报部*LG。请注意*Rab3D公司*表达稍有不同，NOD LGs中表达减少，可能是由于腺泡细胞质量减少。

图7
(A类)半定量RT-PCR显示*百万分之二*,*百万英镑9*,*百万像素13*,*14毫米*,*16毫米*和*Ctsh公司*与年龄匹配的BALB/c和NOD相比，6周龄和18周龄NOD LG-*科学情报部*LG纸巾。(B类)实时RT-PCR分析，使用*Gapdh公司*，证实了半定量PCR结果(**P（P）*与BALB/c和NOD相比<0.05-*科学情报部*LG）。(C类)使用实时RT-PCR分析获得的数据，并使用*拉布3d*.

图8
(A类)与BALB/c和NOD相比，具有代表性的Western blot显示18周龄NOD LG组织中MMP2和MMP9的表达上调-*scid公司*LG。(B类)半定量密度分析显示，与BALB/c和NOD-scid LG相比，NOD LG中前活性和活性MMP2和MMP9显著增加(**P（P）*<0.05). 值以BALB/c控件的百分比表示。

图9
18周龄小鼠NOD-LG组织的免疫荧光染色显示MMP2的强表达(**A、 B类**；蓝色)和MMP9(**C、 D类**；蓝色)在浸润区域显示ECM蛋白表达减少，如I型胶原(**A–D**；绿色). 细胞核（DAPI）如所示白色.比例尺等于100μm(**A、 C类**)和50微米(**B、 D类**).

**图10**
免疫荧光染色显示MMP2上调(绿色；**A–F**)和MMP9(绿色；**G–L**)与BALB/c和NOD相比，18周龄NOD LG组织的炎症区域-*科学情报部*LG（LG）(**B、 E、H、K与A、D、G、J和C、F、I、L的对比**). 图像显示存在组织巨噬细胞（CD68；**A至C**和**G–I型**)和T淋巴细胞（CD4；**D–F型**和**J–L型**)英寸红色以及细胞核（DAPI）蓝色.比例尺等于50μm。

**图11**
免疫组织染色6(**A–C**)和18(**D–F型**)一周前BALB/c(**A、 D类**)，节点(**B、 E类**)和NOD-*科学情报部*(**C、 F类**)LG组织中组织蛋白酶H水平增加(红色)主要见于18周龄的NOD和NOD-*科学情报部*试样(**E和F**)，与CD68阳性组织巨噬细胞共同定位于绿色细胞核用DAPI染色(蓝色). 比例尺等于50μm。

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