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.2010年2月；58(2):392-403.
doi:10.1016/j.neuropharm.2009.09.013。 Epub 2009年10月13日。

在小脑片模拟缺血期间，年轻人和低温（而非女性）延迟ATP丢失和谷氨酸释放，并保护Purkinje细胞

克劳迪娅·莫尔 1, 詹姆斯·德·布雷迪, 大卫·J·罗西
附属公司

在小脑片模拟缺血期间，年轻人和低温（而非女性）延迟ATP丢失和谷氨酸释放，并保护Purkinje细胞

克劳迪娅·莫尔等。 神经药理学. 2010年2月.

摘要

谷氨酸受体过度激活导致脑缺血时浦肯野细胞（PC）损伤，但谷氨酸释放的机制仍存在争议。年龄、性别和温度都会强烈影响缺血性脑损伤，但其影响机制尚不完全清楚。我们确定了年龄、性别和温度如何影响小脑缺血期间ATP丢失、谷氨酸释放、谷氨酸受体激活和PC损伤。我们使用电压箝位PC监测不同年龄、性别、不同温度的小脑片在模拟缺血期间谷氨酸的释放。虽然性别不影响缺血谷氨酸释放，但年轻和低温都会显著延迟谷氨酸释放的开始，而不会影响谷氨酸释放量的大小。年轻和老年PC周围的谷氨酸受体和转运体密度相似，但年轻动物在缺血期间ATP下降的速度因温度降低而显著减慢。绕过缺血诱导的ATP损失，并通过药理学抑制Na（+）/K（+）-ATP酶直接破坏离子梯度，减少了新生和成熟小脑谷氨酸释放时间的差异。新生小脑和成熟小脑的缺血损伤与ATP丢失和谷氨酸释放平行，但阻断谷氨酸受体并不能阻止缺血损伤。因此，年轻或低温对脑缺血的保护作用是由于消耗较慢，从而延迟了ATP的丢失，相应地延迟了谷氨酸的释放和其他不确定的损伤机制。女性提供的保护必须发生在ATP下降、谷氨酸释放和PC上谷氨酸受体激活的下游。

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数字

图1
图1
性别不影响缺血诱导的谷氨酸释放。A、，电压箝位（V）的代表性响应小时=−60mV）女性PC至模拟缺血。B、，雌性（黑色）和雄性（白色）大鼠小脑切片中缺血诱导电流的平均峰值振幅和谷氨酸受体拮抗剂阻断电流的平均振幅（NBQX 25μM+AP5 50μM），如A。C、，缺血诱导电流的平均峰值时间。
图2
图2
新生儿PC中缺血诱导的谷氨酸电流延迟且较小。A、，电压箝位（V）的代表性响应小时=−60mV）成熟（18–21天龄）PC。注意基线电流的灰色虚线延伸，突出显示缺血诱导的残余非谷氨酸电流。B、，新生儿（6-7天大）PC的典型反应（V小时=−60mV）。注意基线电流的灰色虚线延伸，突出显示缺血诱导电流的完整区块。C、，成熟（黑色）和新生（白色）PC中缺血诱导电流的平均开始时间和峰值。D、，成熟（黑色）和新生儿（白色）PC的平均峰值振幅和Iglu。
图3
图3
低温延迟缺血诱导的谷氨酸释放的开始。A、，成熟PC的代表性响应（V小时=−60mV），在接近体温（32–34℃，顶部）和室温（22–23℃，底部）下。B、，新生儿PC的典型反应（V小时=−60mV），在接近体温（顶部）和室温（底部）时。C、，近体（黑色）和室温（白色）下成熟和新生PC的平均峰值时间振幅。D、，近体（黑色）和室温（白色）下成熟和新生PC的平均峰值振幅和Iglu。E、，Purkinje细胞树突状场中的典型场电位记录显示了由谷氨酸介导的大电流驱动的末端去极化。F、，终端去极化的平均峰值时间，如不同温度下的E。
图4
图4
新生儿PC上的AMPA受体较少，说明缺血诱导电流较小。A、，成熟和新生PC的代表性反应（V小时=−60mV）至NMDA（100μM）和AMPA（2μM）。B、，成熟（黑人）和新生儿（白人）PC对AMPA和NMDA的平均反应幅度（如A）。C、，成熟和新生PC缺血诱导谷氨酸电流的平均振幅（图2D中的Iglu）。D、，平均缺血诱导的Iglu用新生儿PC的值重新填满，该值根据对AMPA的反应比率进行缩放（根据图4b所示的数据确定）。
图5
图5
新生和成熟的PC周围环绕着密度相似的谷氨酸转运体。A、，显性神经元谷氨酸转运体EAAT4（绿色）和显性胶质谷氨酸转运体GLAST/EAAT1（红色）免疫细胞化学共焦图像的三维投影。B、，成熟和新生PC对谷氨酸（120μM）和AMPA（2μM）的平均反应幅度，以及每个细胞中这些反应幅度的平均比率（Iglu/IAMPA）。C、，成熟和新生PC的代表性反应（V小时=-60mV），其次是广谱谷氨酸转运体拮抗剂TBOA（300μM），然后是AMPA受体拮抗剂NBQX（25μM）。TBOA感应电流的平均值（占总电流的百分比）绘制在条形图中（右侧）。
图6
图6
年轻和较低的温度减缓了缺血诱导的ATP丢失速率。A、，在接近体温（32–34ºC）的条件下，新生儿和成熟小脑切片的[ATP]作为对照组百分比与控制条件下或缺血时间的曲线图。B、，除室温（22–23ºC）外，与A中相同。在A和B中，灰色箭头指向谷氨酸介导的ID电流发生的平均时间（见图2C），灰色虚线表示该时间点的估计[ATP]。
图7
图7
哇巴因的谷氨酸释放时间差异小于缺血。A、，成熟PC的代表性响应（V小时=−60mV）至哇巴因（600μM）。B、 新生儿PC的典型反应（V小时=−60mV）至哇巴因。C、，成熟（黑色）和新生（白色）PC由缺血或哇巴因诱导的平均峰值电流时间。
图8
图8
杀死PC所需的缺血持续时间与ATP的丢失和谷氨酸的释放平行，但谷氨酸受体拮抗剂无法阻止损伤。A–D，成熟期碘化丙啶（红色）共焦图像的三维投影和钙结合蛋白（绿色）免疫细胞化学(A和B)或新生儿(C&D公司)控制条件下的小脑(艾、碧、慈、狄)或缺血10分钟后(Aii、iii、Bii和Cii)或60分钟(第i项和第iii项)或者单独(Aii、Bii、Cii和Dii)或使用(Aiii和Diii)谷氨酸受体拮抗剂（NBQX 25μM+AP5 50μM）。Aiii中的比例尺为50μm，适用于所有图像。
图9
图9
年轻和低温，但谷氨酸受体拮抗剂不能保护浦肯野细胞对抗模拟缺血。图8所示各种条件下PC和分子层Calbindin信号的平均强度。数值来自至少2种不同动物的3个不同切片中的至少3个小叶。对每只动物的至少1片（通常为2片）进行治疗，以适应所有可能的条件。注：块=25μM NBQX+50μM AP5。
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