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.2009年10月；7（10）：e1000215。
doi:10.1371/journal.pbio.1000215。 Epub 2009年10月13日。

活性Eph的细胞质松弛通过ADAM10控制肾上腺素的脱落

彼得·琼斯 1, Sabine H Wimmer-Kleikamp公司, 阿奇利亚斯·弗兰加基斯, 凯恩高音, 贝蒂娜·格里沙伯, Ola Sabet公司, 马库斯·格拉本鲍尔, 爱丽丝·Y·汀, 保罗·萨夫提格, 菲利普·巴斯蒂安斯, 马丁·莱克曼
附属公司

活性Eph的细胞质松弛通过ADAM10控制肾上腺素的脱落

彼得·琼斯等。 公共科学图书馆生物. 2009年10月.

摘要

A-去整合素和金属蛋白酶（ADAM）跨膜金属蛋白酶释放细胞表面结合配体对细胞因子、细胞粘附和酪氨酸激酶受体的信号传递至关重要。对于Eph受体配体，它提供了细胞间粘附和排斥之间的转换。配体脱落受到固有酪氨酸激酶活性的严格控制，对于Eph受体来说，这依赖于细胞质膜旁段与激酶结构域之间抑制性相互作用的释放。然而，连接激酶和sheddase活性的机制尚不明确。我们证明，潜在激酶结构域的膜近端定位阻止了反式肾上腺素配体脱落。荧光寿命成像显微镜和电子断层扫描显示，激活将Eph受体酪氨酸激酶胞内结构域从细胞膜延伸到促进与ADAM10产生性结合的构象。因此，具有组成性释放激酶域的EphA3突变体有效地支持脱落，即使其激酶被禁用。我们的数据表明，EphA3的磷酸化激活构象开关直接控制ADAM介导的脱落。

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数字

图1
图1。Ephrin脱落受缺乏激酶活性的抑制，但不受EphA3或ADAM10细胞质截短的抑制。
（A） EphA3激酶活性是有效的ephrin裂解所必需的。表达EphA3 Wt或EphA3[KM]的HEK293T细胞（具有突变的ATP-结合位点，K653→M） 用聚集（C）或非聚集（NC）肾上腺素-A5-Fc治疗。用EphA3-Fc下拉法提取分离的ephrin-A5，并回收ephrin-A5，如图所示，对总细胞提取物进行免疫印迹。用肾上腺素-A5-Fc处理的EphA3[KM]细胞观察到的低水平肾上腺素-A5脱落可能是由于亲代HEK293T细胞中存在内源性EphA3。（B） ADAM10 ICD（ΔICD）的截短不影响肾上腺素-A5的裂解和内化。表达内源性ADAM10和EphA3-GFP的细胞转染HA-ADAM10[ΔMP]（顶部）、HA-ADAM1[ΔICD]（中部）或对照载体（底部），并暴露于Alexa594ephrin-A5-Fc涂层珠。EphA3-GFP、内化ephrin-A5和HA-ADAM染色（Alexa647)通过共聚焦显微镜成像。显示了受体表达细胞（平均+/−SEM）的相对肾上腺素-A5标记，有或没有ADAM10[ΔICD]或ADAM10[ΔMP]的共同表达。（C） 在EphA3[Δcyto]表达细胞存在下，从结合珠中分离ephrin-A5。用Alexa培养表达Wt-EphA3-GFP或EphA3[Δcyto]的HEK293T细胞594Alexa染色前的ephrin-A5-Fc结合珠647抗EphA3抗体。共聚焦显微镜图像显示代表性细胞被裂解的肾上腺素-A5染色。合并图像中的假彩色显示：绿色、EphA3-GFP；红色，Alexa594肾上腺素-A5；蓝色，Alexa647抗EphA3抗体。该图显示了细胞的相对肾上腺素标记（平均+/-SEM），含有内化肾上腺素的细胞显示为深灰色，细胞表面肾上腺素显示为浅灰色。
图2
图2。JM结构域的突变影响EphA3磷酸化和ADAM10关联。
（A） 这些研究中使用的Wt-EphA3-GFP和衍生ICD突变体的示意图结构（详见正文）。Y、 酪氨酸；P、 磷酸酪氨酸；E、 谷氨酸（假磷酸化）；十、 非活性激酶。（B） Wt和突变型EphA3的酪氨酸磷酸化。如图所示，用抗磷酸酪氨酸和抗EphA3抗体对ephrin-A5-Fc刺激细胞裂解液中的EphA3-免疫沉淀物进行免疫印迹。（C） ADAM10与Wt和突变体EphA3的结合。通过免疫印迹分析来自Wt或突变（如图所示）EphA3转染细胞（ephrin-A5-treated）的ADAM10免疫沉淀物和总细胞裂解物中的EphA3和ADAM10（见图S4B）。沉淀中EphA3相对于裂解物的平均比率（+/−SD）(n个 = 2个实验），以EphA3[2YE]作为内部参考。
图3
图3。EphA3 JM和激酶域突变分别影响ephrin-A5的脱落和内化。
图4
图4。CaM与嵌合体EphA3/L-选择素结合调节肾上腺素的裂解。
（A） 肾上腺素释放的共聚焦分析：EphA3/L-选择素转染的HEK293T细胞在与Alexa孵育之前，用CaM抑制剂三氟拉嗪二马来酸盐（TFP，15µM）、Calm（2µM488肾上腺素-A5-Fc珠。细胞表面EphA3/L-选择素（Alexa647α-EphA3抗体，红色）和Alexa488通过共聚焦显微镜对固定细胞中的ephrin-A5（绿色）进行成像。插图显示用100µM W7处理的细胞。（B） 根据在相同条件下采集的对照或抑制剂处理的细胞培养物的图像，估计ephrin-A5相关和EphA3/L-选择素相关荧光的比率。平均值如图所示(n个>4） ，误差条表示由多个比较的方差分析测试确定的95%置信区间。（C） 肾上腺素释放的生化分析：用CaM抑制剂（如（A）所示，使用50µM W7）或载体对照预处理EphA3/L-选择素转染的HEK293T细胞，并用ephrin-A5-Fc涂层珠培养。同时，表达EphA3[2YE-KM]的细胞仅与ephrin-A5-Fc包衣珠培养。用α-Ephrin-A5抗体免疫印迹EphA3-Fc下拉回收的Ephrin-A5。用α-EphA3抗体探测总裂解物的EphA3/L-选择素（Eph-Sel）表达（底部）。*表示总裂解物中α-EphA3抗体识别的非相关蛋白质。
图5
图5。FLIM分析显示EphA3激活伴随着细胞质结构域的延伸。
（A） FRET分析示意图；FRET（黄色箭头）反映了EphA3 C终端上GFP与tkRas公司内质膜上的RFP（Kin，激酶域）。（B） EphA3-GFP的共焦FLIM时间序列tkRas公司RFP在ephrin-A5刺激后的指定时间（分钟）共同转染COS7细胞。上排：EphA3-GFP荧光强度图像。中间一行：tkRas公司RFP荧光强度图像。下一行：EphA3-GFP的荧光寿命图像；彩条插图以ns为单位表示荧光寿命范围。（C） 上面板：荧光率τ的二维图−1与tkRas公司EphA3-GFP共焦FLIM系列0分钟（红色）和20分钟（蓝色）的RFP受体强度。时间序列二维序列图的线性拟合用实线表示。下面板：受主归一化能量转移率，kT型/受体，针对EphA3刺激后的选定时间点，根据2D图拟合斜率得出。（D） 上面板：τ的二维序列图−1 tkRas公司ephrin-A5刺激后2YE-EphA3-GFP共焦FLIM时间序列0分钟（红色）和20分钟（蓝色）的RFP受体强度（另见图S6F）。下面板：受体归一化能量转移速率，kT型/时间序列的接受者，如（C）所示。（E） 上面板：τ的二维序列图−1 tkRas公司在ephrin-A5刺激后，3YF-EphA3-GFP共聚焦FLIM时间序列的0分钟（红色）和20分钟（蓝色）的RFP受体强度。下面板：受主归一化能量转移率，kT型/时间序列的接受者，如（C）所示。（F） 左图：荧光速率的2D直方图，τ−1，与EphA3[2YE]、[3YF]和[2YE-KM]的受体强度相对，EphA3[2YE][2YE-KM]是从使用宽场频域FLIM获得的至少16个荧光寿命/受体强度图像中获得的。右侧面板：这些数据的线性拟合显示斜率之间存在显著差异(kT型/EphA3-GFP-[2YE]和EphA3-GFP-[3YF]。
图6
图6。Qdot标记的EphA3的EM揭示了质膜的分子跨度。
（A） AP共焦显微图像N个EphA3/HEK293T细胞，用重组生物素连接酶（BirA）生物素化并用SA-Qdots标记605细胞未受刺激（顶部和中间面板）或肾上腺素受刺激（底部面板）。为了显示SA-Qdots与EphA3结合的特异性，用EphA3-特异性单克隆抗体对样品进行共染色。Qdot染色在合并图像中显示为红色。（B） 生物素化AP的EM图像N个用SA-Qdots标记的EphA3/HEK293T细胞605箭头在细胞外膜上标记EphA3系留的Qdots；插入：（红色）方框区域的放大部分。（C） 描述与NH相连的Q点之间距离的直方图2EphA3末端和质膜。从生物素化AP的EM图像测量距离N个用SA-Qdots培养的EphA3/HEK293T细胞605如（B）所示。（D） SA-Q点605表达AP的微注射细胞C类-EphA3[2YE]和[3YF]，如图所示。每幅图像表示一个10纳米厚的计算切片，该切片是通过EM层析成像进行三维重建后得到的。箭头表示Q点。（E） 表达AP的细胞的整个倾斜序列图像的三维重建C类-EphA3[3YF]（质膜，蓝色；Q点，黄色；用红色箭头标记）。包含相应的电影作为支持信息（视频S1）。（F） 显示非活性EphA3与活性EphA3的细胞质跨度的直方图。在表达生物素化AP的细胞中测量膜Q点距离C类-EphA3[3YF]（蓝色）或APC类-用微量注射SA-Qdots标记的EphA3[2YE]（红色）605.以3 nm的间隔（3YF，n个 = 30; 2年，n个 = 37). 科尔莫戈罗夫·斯米尔诺夫（KS）和t吨统计测试表明(第页<0.001）两个数据集之间的差异。
图7
图7。激活介导的膜近端Eph激酶结构域释放模型，促进ADAM10的高效排列和肾上腺素脱落。
非门控Eph受体的（螺旋）JM段（红色）与激酶的小（N末端）叶相连，使激酶结构域（绿色）保持在非活性的膜近端构象中。Ephrin结合、Eph-聚集（为简单起见，仅示出一对Eph/Ephrin对，而非聚集）、活化和自动磷酸化导致酪氨酸磷酸化JM片段释放到动态无序蛋白质折叠中，从而使激酶结构域和Eph-C末端延伸离开膜。ADAM10与受体构成相关，然后可以通过ADAM10底物识别基序结合Eph/ephrin复合物形成的新位点，进而调节ephrin裂解蛋白酶结构域的正确方向。ADAM10/Eph/ephrin复合物的化学计量比尚待详细说明。重要的是，ADAM10和Eph-RTK的这种生产性比对依赖于RTK配置，其中其激酶域对ADAM10结合的空间位阻被从质膜上移除。
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