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.2009年12月；29(24):6515-26.
doi:10.1128/MCB.00489-09。 Epub 2009年10月12日。

哺乳动物中触发ATF2磷酸化的新型氨基酸反应途径的鉴定

塞德里克·查韦鲁 1, 塞琳·朱塞, 尤恩·切拉西, 安妮·卡瑟琳·莫林, 劳伦特·帕里, 瓦莱里·卡拉罗, Benoit Derijard公司, 阿兰·布鲁哈特, 皮埃尔·法弗努克斯
附属公司

哺乳动物中触发ATF2磷酸化的新型氨基酸反应途径的鉴定

塞德里克·查韦鲁等。 分子细胞生物学. 2009年12月.

摘要

氨基酸的可用性可以控制基因表达，这一点已经得到了很好的证实。先前的研究表明，氨基酸耗竭通过位于启动子中的氨基酸反应元件（AARE）诱导ATF3（激活转录因子3）基因的转录。这一事件需要激活转录因子2（ATF2）的磷酸化，ATF2是一种组成AARE结合因子。为了确定在氨基酸饥饿时导致ATF2磷酸化的信号级联，我们使用了通过小干扰RNA转染的个体基因敲除方法。我们确定有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）模块MEKK1/MKK7/JNK2是负责苏氨酸69（Thr69）和Thr71残基上ATF2磷酸化的途径。然后，我们逆着信号转导途径进行，发现GTPase Rac1/Cdc42和蛋白Galpha12控制MAPK模块、ATF2磷酸化和AARE依赖性转录。综上所述，我们的数据揭示了氨基酸饥饿激活的新信号通路，导致ATF2磷酸化，随后积极影响氨基酸调节基因的转录。

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数字

图1。
图1。
ATF2在ATF3对氨基酸饥饿反应的转录调控中的作用。（A） ATF2型−/−，ATF4−/−和野生型（WT）MEF在对照或无亮氨酸（−Leu）培养基中培养4小时，然后收获。按照材料和方法中的描述，提取总RNA并通过定量RT-PCR分析ATF3 mRNA含量。每个点代表三个独立实验结果的平均值。我们使用ATF2的野生型对应物获得了相同的结果−/−和ATF4−/−MEF（未显示）。（B） 使用ATF4、ATF2和磷酸化ATF2（Thr71）特异性抗体进行ChIP分析。用免疫沉淀DNA和稀释的输入DNA样品进行定量RT-PCR，使用引物扩增ATF3启动子的AARE区域。数据绘制为来自免疫沉淀DNA的PCR产物与输入DNA的百分比。每个点代表三个独立实验结果的平均值，误差条代表平均值的标准误差（*表示对值<0.05）。IgG、免疫球蛋白G（C）细胞在对照或无亮氨酸培养基中培养，并在指定的培养时间后收获。如材料和方法所述，使用核提取物对磷酸化-ATF2（Thr71和Thr69+Thr71）和总ATF2进行蛋白质印迹分析。（D） 在对照培养基（Ctrl）或不含单个氨基酸（亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸或谷氨酰胺）的培养基中培养细胞4小时，然后分析磷酸-ATF2（Thr69+Thr71）、ATF2和ATF4。
图2。
图2。
亮氨酸饥饿时ATF2磷酸化不涉及GCN2和mTORC1途径。（A） 细胞与10 mM亮氨酸孵育指定时间，然后如前所述分析ATF2磷酸化和ATF4表达。用20μg/ml茴香霉素（Aniso）培养30分钟，作为ATF2磷酸化测量的阳性对照。（B） GCN2型+/+或GCN2−/−MEF在对照或无亮氨酸培养基中孵育2和4 h。然后收集细胞，以分析ATF4的表达和ATF2和eIF-2α的磷酸化。（C） 细胞被亮氨酸饥饿4小时或用50 nM雷帕霉素（Rapa）处理4小时，然后测量ATF2和S6K的磷酸化。
图3。
图3。
JNK的药理抑制通过亮氨酸饥饿阻止ATF2磷酸化。在各种MAPK抑制剂（20μM SB203580抑制p38，50μM U0126抑制MEK1/2，从而抑制ERK，20μM JI8和50μM SP600125抑制JNK）存在的情况下，在对照或无亮氨酸培养基中培养细胞4小时。然后测量ATF2的磷酸化。在本实验中，细胞首先用MAPK抑制剂或载体（二甲基亚砜[DMSO]）预培养1小时。
图4。
图4。
siRNA沉默JNK2可通过亮氨酸饥饿阻止ATF2磷酸化。（A） 细胞在对照或无亮氨酸培养基中培养，并在指定的培养时间后收获。测定JNK（Tyr185）和ATF2的磷酸化形式。每个印迹都是从三个独立实验中的一个代表性实验中获得的。（B） 如材料和方法中所述，用对照siRNA、JNK1 siRNA、KNK2 siRNA或靶向JNH1和JNK2的siRNA转染HeLa细胞。在转染后72小时，细胞在DMEM或无亮氨酸DMEM中培养4小时，然后收获用于分析ATF2、JNK1、JNH2、ATF4和ATF2的磷酸化形式。每个印迹都是从三个独立实验中的一个代表性实验中获得的。
图5：。
图5：。
敲除MKK7或MEKK1抑制亮氨酸饥饿诱导的ATF2磷酸化。（A） 用对照siRNA、MKK4 siRNA、PKK7 siRNA或MKK4-siRNA和MKK7-siRNA转染HeLa细胞。在转染后72小时，细胞在DMEM或无亮氨酸DMEM中培养4小时。然后收集细胞用于分析MK4、MK7、ATF4和磷酸化形式的ATF2，如前所述。（B） 如前所述，沉默MEKK1、MEKK2、MEK03或所有三种蛋白质。然后，分析MEKK1、MEKK2、MEK03、ATF4的表达水平和ATF2的磷酸化形式。（C） 对转染对照、MKK7或MEKK1 siRNA的细胞的蛋白提取物进行JNK磷酸化分析。每个印迹都是从三个独立实验中的一个代表性实验中获得的。
图6。
图6。
沉默Cdc42和Rac1可防止ATF2磷酸化以应对亮氨酸饥饿。如前所述，Rac1、Cdc42或两者均被静音。检测ATF2的磷酸化形式以及Rac1、Cdc42和ATF4的表达。每个印迹都是从四个独立实验中的一个代表性实验中获得的。
图7。
图7。
Gα12蛋白参与亮氨酸饥饿诱导的ATF2磷酸化。用对照siRNA、Gα12 siRNA、Gα13 siRNA或Gα12 siRNA和Gα13 siRNA转染HeLa细胞。转染后72小时，细胞在DMEM或无亮氨酸DMEM中培养4小时。然后收集细胞用于分析Gα12、Gα13、ATF4和ATF2的磷酸化形式，如前所述。每个印迹都是从三个独立实验中的一个代表性实验中获得的。（B） 用Gα12活化突变体（Gα12 QL）或空载体（pcDNA3）转染HEK293细胞。在转染后48小时，裂解细胞，然后收获蛋白质用于Gα12的分析，并如前所述测量ATF2和JNK的磷酸化形式。
图8。
图8。
JNK2和Rac1/Cdc42在ATF3对氨基酸饥饿反应的转录调控中的作用。（A） 用对照siRNA、JNK1 siRNA或JNK2 siRNA转染HeLa细胞，然后在对照培养基或无亮氨酸培养基（−Leu）中培养4 h，如图4A所示。然后提取总RNA并通过实时RT-PCR分析ATF3或ASNS mRNA含量。（B） 用适当的siRNA转染细胞，并用含有两个拷贝的报告质粒转染细胞自动变速箱3或CHOP公司AARE将5′插入驱动Luc基因的胸苷激酶启动子（2xAARE-T型k个-Luc）。由巨细胞病毒启动子驱动的编码β-半乳糖苷酶的质粒被共转染以使转染正常化（见材料和方法）。转染后48小时，细胞在DMEM或无亮氨酸DMEM中培养16小时，然后收获以测量Luc活性。（C） 用对照siRNA或Rac1 siRNA和Cdc42 siRNA转染HeLa细胞。然后按照面板B所述对细胞进行处理和分析。所有值均为根据至少三次独立实验的结果计算的平均值，共三次。数据表示为平均值±平均值标准误差。使用Student测试进行统计分析。星号表明−Leu/siRNA处理的细胞在对与−Leu/对照siRNA处理的细胞相比，值<0.05。
图9。
图9：。
氨基酸饥饿诱导人类细胞中AARE依赖性转录的模型。为了应对氨基酸饥饿，激活了两条途径。第一个被不带电荷的tRNA激活，导致ATF4诱导。第二个涉及Gα12蛋白并导致ATF2磷酸化。
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