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.2010年1月；9(1):32-53.
doi:10.1074/mcp。M900396-MCP200。 Epub 2009年10月7日。

牛分枝杆菌Calmette-Guerin吞噬体蛋白质组

李白玉 1, 迪帕·杰特瓦尼, 比吉特·席林, 丹尼尔·克莱门斯, 布拉德福德·W·吉布森, 马库斯·A·霍维茨
附属公司

牛分枝杆菌Calmette-Guerin吞噬体蛋白质组

李白玉等。 分子细胞蛋白质组学. 2010年1月.

摘要

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌卡介苗（BCG）改变其吞噬体的成熟度，并驻留在抵抗酸化和与溶酶体融合的隔间内。为了确定该隔室的分子组成，我们开发了一种从感染卡介苗的人类巨噬细胞中获得高纯度吞噬体的新方法，并通过Western免疫印迹和基于质谱的蛋白质组学分析了吞噬体。我们的纯化程序显示，在人工培养基上生长的BCG在巨噬细胞中生长后密度降低。通过Western免疫印迹法，在卡介苗吞噬体上很容易检测到LAMP-2、Niemann-Pick蛋白C1和syntaxin 3，但其水平低于乳胶珠吞噬体；在卡介苗吞噬体上几乎检测不到flotillin-1和液泡ATP酶，但在乳胶粒吞噬体上高度富集。免疫荧光研究证实了卡介苗吞噬体上的浮子蛋白缺乏，并证明了细菌代谢活性与结核分枝杆菌吞噬体上浮子蛋白呈负相关。通过质谱分析，在卡介苗吞噬体上鉴定出447种人类宿主蛋白，在乳胶粒吞噬体上识别出289种人类蛋白的部分重叠集。有趣的是，卡介苗吞噬体制剂上一致鉴定的大多数蛋白质也在乳胶珠吞噬体上鉴定，这表明这两个部分的蛋白质组成高度重叠。蛋白质组成的许多差异在本质上可能是定量的，而不是定性的。尽管蛋白质组成存在显著重叠，但我们始终在卡介苗吞噬体上鉴定出许多在我们的任何乳胶粒吞噬体制剂中未鉴定出的蛋白质，包括参与膜运输和信号转导的蛋白质，例如Ras GTPase活化样蛋白IQGAP1，和功能未知的蛋白质，如FAM3C。我们的吞噬体纯化程序和初步蛋白质组学分析为分枝杆菌和乳胶珠吞噬体蛋白质组的定量比较分析奠定了基础。

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数字

图1。
图1。
感染后3天，来自THP-1细胞的牛分枝杆菌BCG吞噬体在碘克沙醇密度梯度上沉积。 A类，人THP-1巨噬细胞被允许吞噬活的或杀死的牛支原体BCG-GFP或不治疗(伪装)感染后3天，纯化了一个吞噬体部分。假吞噬体制剂的处理方法与其他吞噬体制剂相同，只是在孵育期结束而不是开始时以及均质前立即将牛支原体卡介苗添加到巨噬细胞中。所有制剂中的巨噬细胞均被均质化，PNS组分通过低速离心获得，吞噬体组分通过15%蔗糖离心至30%碘克沙醇获得。从界面收集卡介苗吞噬体（假制剂中的游离卡介苗），并将其应用于线性碘氧醇梯度。从底部收集梯度组分，用一维SDS-PAGE和Western免疫印迹法分析代表碘克沙醇梯度或PNS等分（分别为整个梯度的0.06%或总PNS的0.06%）的等分样品。每个梯度组分的BCG-GFP相对数量是通过将每个组分的等分样品与甲醛混合，并通过荧光显微镜计算每个400×场的绿色荧光细菌数量来确定的。卡介苗吞噬体比大多数线粒体和内质网要轻，并进入编号较高的部分。虽然LAMP-2与卡介苗吞噬体共沉积，但线粒体抗原标记物和ER标记物（钙网蛋白和BiP）主要存在于密度较高的组分中。虽然PNS中含有丰富的线粒体标记VDAC和ER标记BiP，但大多数这些细胞器在线性碘氧醇梯度（通过15%蔗糖的低速沉淀）之前的纯化步骤中被去除，因此在碘氧醇的梯度组分中含量较低。S公司，假；K（K），卡介苗死亡；L（左）、活卡介苗；M、 分子质量标记车道。B类通过SDS-PAGE和Western免疫印迹分析细胞器标记的梯度组分，显示了活卡介苗吞噬体和假卡介苗噬菌体在碘克沙醇梯度上的纯化的独立复制。卡介苗吞噬体与LAMP-2和组织蛋白酶D的强条带共同洗脱A类，大多数ER和线粒体在线性碘xanol梯度之前的步骤中被去除。通过钙网蛋白染色可以发现一些残余ER，大多数位于比卡介苗吞噬体密度更高的组分（编号更低的组分）中，尽管一些钙网蛋白确实可以共同洗脱。线粒体（线粒体抗原锰超氧化物歧化酶染色(锰-SOD)和VDAC）也以比卡介苗吞噬体密度更高的部分洗脱。在PNS中富含氯氰菊酯（存在于质膜上）和moesin（一种细胞骨架标记物），但在含有卡介苗吞噬体的峰段中未通过免疫染色检测到。
图2。
图2。
通过SDS-PAGE和电子显微镜分析感染后3天从THP-1细胞纯化的BCG吞噬体。 A类，感染后3天从THP-1细胞中纯化的卡介苗吞噬体(卡介苗噬菌体)和假吞噬体(伪装)用相同处理的未感染THP-1细胞制备，在孵育期结束而不是开始时以及均质之前，将卡介苗添加到一维SDS-PAGE梯度凝胶中，并用SYPRO Ruby对蛋白质进行染色。标准分子质量标记物的质量（车道标记为“米“）以kDa表示。B类和C类PNS起始材料的透射电子显微镜（通过10000×离心造粒克持续10分钟）(B类)和最终纯化的BCG-GFP吞噬体颗粒(C类)证明纯化的吞噬体(C类)与PNS起始材料相比，卡介苗吞噬体的污染相对较少，且大量富集(B类).尺寸栏，1微米。
图3。
图3。
用免疫印迹法分析THP-1细胞3天纯化的卡介苗吞噬体。 A类LAMP-2、calnexin、60-kDa线粒体抗原和分枝杆菌LAM水平的比较。用Western免疫印迹法分析感染后3天从PNS或从THP-1细胞制备的卡介苗吞噬体中含有5-40μg蛋白质的样品。虽然LAMP-2和分枝杆菌LAM在卡介苗吞噬体上的富集程度与每μg蛋白质在PNS中的含量有关，但calnexin的水平显著降低，60-kDa线粒体抗原(水户)在纯化的卡介苗吞噬体部分中未检测到。B类、氯氰菊酯、钙连蛋白、线粒体抗原水平的比较(水户)、LAM、Rab-11和半乳糖凝集素-1。另一项单独的免疫印迹实验表明，卡介苗吞噬体制剂中LAM的富集以及相对于PNS中的水平而言，低水平的calnexin的持续存在。相反，在PNS中检测到了网格蛋白、线粒体抗原、Rab-11和半乳糖凝集素-1，但在卡介苗吞噬体制剂中未检测到。
图4。
图4。
用免疫印迹法分析3天纯化的卡介苗吞噬体、乳胶粒吞噬体和PNS。用Western免疫印迹法分析含有5-40μg PNS蛋白、纯化卡介苗吞噬体或感染后3天从THP-1细胞制备的纯化乳胶珠吞噬体的样品。相对于卡介苗吞噬体和PNS上观察到的水平，NPC1、LAMP-2和syntaxin 3在乳胶粒吞噬体上富集。Flotillin-1和vATP酶在乳胶粒吞噬体上高度富集，而在卡介苗吞噬体上相对缺乏。另一方面，细胞骨架蛋白stathmin在PNS中检测到，但在乳胶珠或卡介苗吞噬体制剂中未检测到。
图5。
图5。
结核分枝杆菌THP-1细胞吞噬体上的Flotillin-1免疫荧光与分枝杆菌的代谢活性呈负相关。 A类，的代谢活性结核分枝杆菌-通过在感染后加入IPTG和在感染后48小时固定时绿色荧光蛋白表达的可视化来评估iGFP(一和d日)、和结核分枝杆菌-iGFP与代谢状态无关，通过氨基甲基香豆素标记的抗LAM抗体的蓝色荧光显示(一和d日). 用德克萨斯州红色标记的抗人鱼群蛋白-1抗体染色，观察鱼群蛋白1的分布(b条和e（电子）). 合并的彩色图像显示在正确的(c（c）和（f）). 代谢不活跃结核分枝杆菌-iGFP（IPTG诱导后不表达GFP的细菌；a–f,箭头)始终与标有德克萨斯红的flotillin-1共存(箭头表明有三种细菌b条和一种细菌e（电子）). 新陈代谢活跃的结核分枝杆菌-国际绿色食品计划(a–c,箭头)与flotillin-1的共定位较弱且不太一致(b条).B类，flotilin-1的定量评估免疫荧光显示flotilin-1在代谢活性上的共定位水平相对较低结核分枝杆菌-国际绿色食品计划(GFP公司+结核分枝杆菌），而非活性结核分枝杆菌-国际绿色食品计划(GFP公司−结核分枝杆菌），福尔马林灭活结核分枝杆菌-GFP公司(被杀结核分枝杆菌）和THP-1细胞感染后48小时（和IPTG诱导后46.5小时）的乳胶珠。实验进行了两次，结果相似。所示值为平均值，误差条表示至少40个细菌或珠的重复测定的S.D。
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