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.2009年11月；20(22):4790-803.
doi:10.1091/mbc.e09-07-0560。 Epub 2009年9月30日。

小鼠CENP-F调节中心体微管成核并在中心体与Hook2相互作用

凯瑟琳·莫伊尼汉 1, 瑞恩·普利, 保罗·M·米勒, 伊琳娜·卡维琳娜, 大卫·M·贝德
附属公司

小鼠CENP-F调节中心体微管成核并在中心体与Hook2相互作用

凯瑟琳·莫伊尼汉等。 分子生物学细胞. 2009年11月.

摘要

微管（MT）网络在广泛的细胞功能中至关重要。许多研究将CENP-F与基于MT的活动联系起来，因为这种蛋白质的破坏会导致MT结构和功能的重大变化。尽管如此，欧洲核物理委员会（CENP-F）对机器翻译网络的监管基础仍然难以捉摸。在这里，我们的研究揭示了CENP-F在中心体（细胞的主要MT组织中心）的一种新的关键定位和作用。使用酵母双杂交筛选，我们将Hook2（一种对中心体MT网络的调节至关重要的连接蛋白）鉴定为CENP-F的结合伴侣。通过最近开发的免疫化学试剂，我们证实了这种相互作用，并揭示了CENP-F在中心体的新定位。重要的是，在这篇关于CENP-F（-/-）细胞的首次报告中，我们证明了CENP-F蛋白功能的消融消除了标准诺科达唑治疗后的MT再聚合。这种对MT再生的抑制是中心体特异性的，因为在CENP-F（-/-）细胞中很容易从高尔基体观察到MT的重新聚合。CENP-F在调节MT生长中的中心体特异性功能通过仅包含Hook2-binding结构域的截短CENP-F的表达得到证实。此外，对逃避完全重新聚合阻滞的细胞中部分重建的MTOC aster的分析表明，CENP-F功能的破坏影响MT成核和锚定，而不是促进灾难。我们的研究揭示了CENP-F在中心体的一个主要新定位和功能，可能会影响细胞内广泛的基于MT的行为。

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图1。
图1。
CENP-F/Hook2相互作用的鉴定和结合域的表征。（A） CENP-F蛋白结构域示意图。我们最初的Y2H屏幕使用LEK卷曲区域（LCR）作为诱饵，并确定Hook2直接与CENP-F（B）CENP_F截断构造相互作用。（C） Hook2截断构造。在右边的列中，+表示正增长，而−表示无增长。将截短物转化为相应的酵母菌株，以确定正相互作用。（D） Hook2截短与NT-CENP-F、对照和酵母生长平板的配比示意图。（E） 在Gal测试中，阳性相互作用增加并呈现蓝色。用pGBKT7-53和pGADT7-T转化的酵母显示阳性对照生长，我们的阴性对照使用表达pGBTK-53和空载体pGADT7的酵母。
图2。
图2。
瞬时表达的CENP-F和Hook2蛋白在中心体上相互作用。COS-7细胞与NT-CENP-F-myc和Hook2-GFP共转染。（A） 转染COS-7细胞的免疫共沉淀。用α-myc拖出裂解液样品，并用α-GFP进行印迹。（B–D）单转染NT-CENP-F-GFP与γ-微管蛋白中心体标记物（箭头）共定位。（E–G）单转染的Hook2-GFP与γ-微管蛋白（箭头）共定位。（H–K）与γ-微管蛋白（箭头）共定位的共表达NT-CENP-F-myc和Hook2-GFP。中心体未转染的γ-微管蛋白用箭头标记。棒材10μm。
图3。
图3。
内源性CENP-F和Hook2蛋白在中心体相互作用和共定位。（A） 与C2C12细胞的内源性共免疫沉淀。用CENP-F抗体拖出裂解液样品，并用Hook2抗体进行印迹。第三列显示，在下拉过程中未使用CENP-F抗体时，未下拉Hook2。（B–J）在C2C12细胞中使用CENP-F、Hook2和γ-微管蛋白的内源性抗体来显示所有三种蛋白质的共定位。（B） γ-微管蛋白中心体标记。（C） 挂钩2。（D） 与差分干涉对比度（DIC）合并。（E） γ-微管蛋白。（F） CENP-F（G）合并。（H）CENP-F.（I）挂钩2。（J） 与DIC合并。箭头显示共定位，箭头显示其他蛋白质定位。棒材10μm。
图4。
图4。
破坏CENP-F/Hook2相互作用会干扰诺康唑激发后MT的重新聚合。（A） WT和CENP-F−/−分离MEF并进行基因分型。顶部带使用PCR引物侧翼漂浮CENP-F等位基因的5′loxP位点，确定漂浮与WT。底部带使用PCR PCR引物，侧翼整个漂浮序列，仅在内部序列被切除后才允许有效PCR，因此发生了“重组”。（B） CENP-F的RT-PCR确认−/−中小微企业。NDRG4引物和C2C12裂解物作为阳性对照。（C–D）WT和CENP-F−/−用诺卡唑处理细胞，用新鲜培养基洗涤，5分钟后固定。（C）WT MEF显示重建的MT网络，而（D）CENP-F−/−MEF显示MT没有重新聚合。MT标记为红色。（E–G）NT-CENP-F（绿色）的表达取代了中心体（箭头）的内源性Hook2（红色）表达。箭头表示未转染细胞中典型的Hook2定位于中心体。（H–M）用NT-CENP-F-GFP转染四个细胞系，用诺卡唑处理2 H，用培养基清洗，然后让其恢复。转基因构建物用箭头标记为绿色，MT标记为红色，细胞核用4,6-二氨基-2-苯基吲哚标记为蓝色。（H–L）箭头表示未转染细胞中MTOC aster的形成，而箭头表示NT-CENP-F表达细胞没有MTOC ister。（H） 洗脱后5分钟的COS-7细胞（I）5分钟的HeLa细胞（J）10分钟的C2C12细胞（K）20分钟的3T3细胞（L）COS-7的冷处理现象诺卡唑处理。（M） 阴性对照C末端CENP-F构建物（箭头）没有相同的效果，显示了该表型的特异性。（N） 5分钟后COS-7细胞中MTOC aster形成的定量。灰色表示有MTOC ister的细胞计数百分比，而黑色表示没有MTOC ester的细胞百分比。WT细胞在>90%的细胞中重建MTOC aster，而NT-CENP-F-表达的细胞重新聚合<10%的MTOC。P<0.0001。棒材，10μm。
图5。
图5。
CENP-F对MT重新聚合的破坏具有中心体特异性，并抑制MT的快速成核。（A） 用NT-CENP-F（绿色）转染RPE细胞，用诺康唑处理，并标记MT（红色）、高尔基膜（深蓝色）和细胞核（4,6-二氨基-2-苯基吲哚，青色）。转染的细胞显示MT aster重聚减弱，但插入物显示MT与细胞质中的高尔基体膜相关（箭头）。（B） 中央处理器−/−用诺卡唑治疗MEF，恢复5分钟后固定。插图显示与高尔基膜相关的MT（箭头）。MT用红色标记，高尔基用绿色标记。WT COS-7细胞（C–G）和NT-CENP-F转染细胞（H–L）均转染了EMTB-GFP，这是一种MT标记物，用诺康唑孵育，洗脱后立即在1帧/20秒下成像20分钟在表达NT-CENP-F的细胞中，EMTB-GFP池在整个20分钟内保持细胞质。成像后，检查培养皿中未转染的细胞，并显示MTOC完全恢复（数据未显示）。棒材，10μm。
图6。
图6。
CENP-F在MTOC成核和锚定中发挥作用。检测表达NT-CENP-F的COS-7细胞对MT解聚的不完全抑制作用。显示了各种表型。（A） 稀疏且无组织的MT，最常见于NT-CENP-F表达细胞。（B） 稀疏的紫菀。（C） 杂乱无章的MTs.（D）短小、杂乱无序的aster。（E） 沿谱对每个表型进行量化。棒材，10μm。
图7。
图7。
通过CENP-F破坏和缺失，中心体蛋白质重新分布。表达NT-CENP-F的（A–F）COS-7细胞显示CENP-F截断点与ninein和PCM-1共定位。箭头表示中心体蛋白表达正常，与NT-CENP-F异常共定位用箭头标记。（A） NT-CENP-F.（B）ninein公司。（C） 合并。（D）NT-CENP-F.（E）PCM-1。（F） 合并（G–L）WT和CENP-F−/−MEF标记为PCM-1（红色）和γ-微管蛋白（绿色）。（一） PCM-1在WT MEF中与γ-微管蛋白明确定位，而在（L）CENP-F中−/−MEF，PCM-1呈弥漫性细胞质。棒材，10μm。
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  • 分子生物学细胞。20:4629.

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