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.2009年9月24日；35(6):856-67.
doi:10.1016/j.molcel.2009.09.006。

低氧诱导mir-210调节参与肿瘤发生的正常氧基因表达

Xin Huang（新黄） 1, 梁浩鼎, 凯文·本尼维思, Ricky T Tong先生, 斯科特·M·韦尔福德, K Kian Ang公司, 迈克尔故事, Quynh-Thu Le村, 阿马托·J·贾西亚
附属公司

低氧诱导mir-210调节参与肿瘤发生的正常氧基因表达

Xin Huang（新黄）等。 分子电池. .

摘要

以往的研究表明，HIF转录因子可以激活和抑制基因表达。在这里，我们发现HIF1通过低氧反应元件调节多种肿瘤类型中mir-210的表达。在头颈部原发肿瘤样本中的表达分析表明，mir-210可能是肿瘤缺氧的体内标志物。通过精氨酸蛋白免疫沉淀，我们确定了50个潜在的mir-210靶点，并对随机选择的靶点进行了验证。这50个基因中的大多数不是经典的缺氧诱导型基因，这表明mir-210抑制在常氧条件下表达的基因，这些基因不再是适应和在缺氧环境中生存所必需的。当将体外表达mir-210的人头颈部或胰腺肿瘤细胞植入免疫缺陷小鼠体内时，mir-210抑制肿瘤生长的启动。综上所述，这些数据表明mir-210在调节肿瘤细胞缺氧反应和肿瘤生长方面具有重要作用。

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图1
图1
Mir-210是主要的低氧反应miRNA。A）对细胞缺氧反应期间诱导的miRNA进行微阵列分析。缺氧处理前24小时将SU86.86和SU86.86/shHIF1α细胞分为两个平板。一个平板保持在常氧状态，另一个平板暴露在2%的氧气中2持续16小时。然后在同一时间收获RNA并用于进行微阵列分析。数据显示在散点图上，该散点图显示了Cy3标记的常氧对照和Cy5标记的低氧样品（顶部面板）两个通道上每个探针的log10-转换信号强度。在平行染料交换实验中，常氧样品用cy5标记，缺氧样品用cy3标记（底部面板）。mir-210被认为是诱导最有力的miRNA，其诱导依赖于HIF1α。B） Western blot证实在微阵列实验中使用的SU86.86细胞中shRNA构建可以有效地敲除HIF1α；C） Northern blot检测mir-210在不同缺氧强度下的诱导表达。治疗前24小时将SU86.86细胞分成四个平板。然后将每个平板暴露于常氧、2%、0.5%或<0.02%（缺氧）O中224小时。小核糖核酸U6作为负荷对照；D） 2%O下mir-210诱导动力学2SU86.86单元中。mir-210的表达在缺氧24小时后达到平台，并持续高达48小时（上图），这与对照组一致，GLUT1公司，一个经典的HIF调节基因（中间面板）。HIF1α的Western blot显示为缺氧状态（下图）。
图2
图2
Mir-210广泛表达，是HIF1α特异性基因。A） 在所有六种不同的肿瘤类型中均检测到缺氧上调mir-210。在治疗前24小时，将每个细胞系分成两个相同的平板。一个暴露在2%的O中2另一个保持在常压下24小时，然后同时采集RNA并用于Northern印迹。RCC4/VHL和786/VHL是具有稳定重组的野生型VHL基因的RCC4和786-O细胞系。mir-210在几乎所有被检测的细胞系中都能被缺氧诱导，在HSC3、MCF10A和MCF7细胞中诱导率最高。然而，在MDA231、SQB20和786-O细胞中几乎没有缺氧上调。U6 RNA作为负荷对照；B） MDA-MB-231和配对RCC4，786-O细胞中HIF1α和HIF2α的Western blot。在2%氧浓度下，786-O和MDA-231细胞中未检测到HIF1α2然而，HIF2α可以在所有细胞系中很容易检测到。C） 通过qPCR检测从RCC4/VHL细胞收获的RNA中mir-210的表达，其中siRNA敲低HIF1α、HIF2α，或加扰对照siRNA，暴露或不暴露于2%O224小时（下面板）。RNA输入在小核糖核酸RNU48上进行标准化。上面板显示这些细胞中HIF1α和HIF2α的缺氧诱导和siRNA敲除。
图3
图3
mir-210启动子中功能性HRE的鉴定。A） mir-210基因组结构示意图。克隆的启动子与mir-210编码区相关的位置如上图所示。开盒表示mir-210的编码区，实线表示克隆的2.3kb启动子。底部面板显示了跨物种mir-210基因组序列的保存情况，该面板来自UCSC数据库(http://genome.ucsc.edu). B） mir-210启动子分析。将启动子片段克隆到pGL3-Basic载体中；5XHRE构造，包括人类的五个副本血管内皮生长因子HRE作为阳性对照。序列缺失结构（由图中间的字母A–H标识）在左边的条形图中以示意图的形式表示，而它们在正常氧（灰色条）和2%氧（黑色条）中的相对启动子活性显示在图的右侧。顶部的黑色小条表示十个潜在HRE的相对位置。柱状图顶部的箭头表明，这种HRE对于缺氧条件下启动子活性的上调至关重要。开盒表示mir-210编码序列；C） HRE序列的突变消除了mir-210启动子对HIF1α的反应性。结构A和H如图所示。上面板显示，根据UCSC数据库，HRE位点周围的序列是mir-210启动子中物种间唯一高度保守的区域。构造H中31-72的保守核苷酸用星号表示。HRE核心的三个核苷酸突变以粗体字母表示。下部面板显示了有/无HRE突变的构造H的荧光素酶分析。误差线表示标准偏差。D） mir-210启动子的ChIP分析。上面板，mir-210启动子上ChIP引物的相对位置。下部面板，ChIP结果。HSC3细胞分别在常氧或0.5%氧气下培养4小时和20小时。用特异于功能性mir-210 HRE（HRE）的引物和HRE位点上游约500bp的区域作为对照（Ctrl）进行PCR。IgG是指为IP阴性对照而衍生的样本，HIF1α是指用HIF1α抗体免疫沉淀的DNA，Input是指免疫沉淀前从样本中衍生的DNA。
图4
图4
miRNP-IP鉴定mir-210靶基因。A） 识别mir-210目标的战略示意图。B） Venn图显示了四个计算程序（TargetSachn、PicTar、miRanda和PITA）预测的潜在mir-210靶基因以及在miRNP-IP实验中富集的基因。C） 确定了50个潜在的mir-210靶基因。验证中使用的四个基因以灰色突出显示。这个FGFRL1公司阵列2中富集度略低于2倍的基因也列在列表的底部。显示的值是标准化日志2（R/G）。
图5
图5
通过miRNP IP鉴定的随机选择的mir-210靶基因的验证。A） pGL3-蛋白质载体和B）CTGF公司3′UTR结构作为阴性对照。它们对野生型或突变型mir-210的表达没有反应。C-G）报告荧光素酶活性被mir-210野生型或突变表达载体与HOXA1型,HOXA9型,TP53I11型,个人信息管理1、和FGFRL1公司3′UTR构造。H） mir-210表达结构的突变。在mir-210的种子区引入了四核苷酸突变。每个报告者分析至少重复三次。误差栏表示标准偏差。进行学生t检验进行统计分析，**p<0.001，*p<0.05。
图6
图6
Mir-210在小鼠异种移植模型中抑制肿瘤生长。A） 将异位表达mir-210的FaDu细胞和亲代细胞以10倍的密度注入裸鼠体内6细胞。父母组N=6，210E组N=7。B） 将异位表达mir-210的SU86.86细胞和亲代细胞以107细胞。每组N=5。肿瘤体积表示为FaDu细胞异种移植前四周的平均±SEM.C）肿瘤生长。D） 肿瘤生长在SU86.86细胞异种移植的前7周。左图，无异位mir-210表达的细胞；右幅，细胞异位mir-210表达。E） 通过TaqMan RT-PCR从有/无mir-210异位表达的异种移植瘤样本中测量mir-210的表达。还从注射肿瘤后剩下的相同肿瘤细胞中检测mir-210的表达。RNA输入在小核糖核酸RNU48上进行标准化。父母组和210E组的mir-210表达存在显著差异（学生t检验，p=0.025）。F） 异种移植瘤的大小与相应的mir-210表达水平呈负相关。底部和顶部虚线分别表示mir-210在亲代细胞和异位表达mir-210的细胞中的表达水平。
图7
图7
HOXA1由mir-210调节体内.A）收集的肿瘤异种移植物样本中的HOXA1蛋白。顶面板，每个样本中mir-210的表达；底部面板，对应样品中HOXA1蛋白水平。顶部面板中的左箭头和右箭头分别表示输入的亲代和输入的mir-210表达细胞。虚线表示具有mir-210表达和HOXA1蛋白水平的倒置图谱的两组样品。B） mir-210对肿瘤生长起始的抑制作用通过表达HOXA1型或FGFRL1公司没有3′UTR区域的编码序列。每组FaDu细胞以2.5x10的密度在裸鼠体内进行皮下注射6细胞。每组N=7。C） 表达个人信息管理1无3′UTR区的编码序列对mir-210抑制肿瘤生长的作用没有影响。每组FaDu细胞以3x10的密度在裸鼠体内进行皮下注射6细胞。每组N=7。
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