Characterization of tafazzin splice variants from humans and fruit flies

doi:10.1074/jbc.M109.016642

.2009年10月16日；284(42):29230-9.

doi:10.1074/jbc。2016年9月16日，642美元。 Epub 2009年8月21日。

人类和果蝇tafazzin剪接变异体的特征

杨旭¹, Shali Zhang先生, 阿希姆·马尔霍特拉, 艾丽特·埃德尔曼·诺维姆斯基, 马金平, 安东尼娜·克鲁帕, 卡罗来纳州Cernicica, 史蒂文·布莱斯, 托马斯·诺伊伯特, 民东任, 迈克尔·施拉姆

附属公司

PMID： 19700766
预防性维修识别码：项目经理2781466
内政部： 10.1074/jbc。M109.016642

人类和果蝇tafazzin剪接变异体的特征

杨旭等。生物化学杂志. 2009.

.2009年10月16日；284(42):29230-9.

doi:10.1074/jbc。M109.016642。 Epub 2009年8月21日。

作者

附属

¹美国纽约州纽约市纽约大学医学院麻醉系，邮编：10016。

PMID： 19700766
预防性维修识别码：项目经理2781466
内政部： 10.1074/jbc。M109.016642

摘要

tafazzin基因编码一种参与心磷脂代谢的磷脂-溶磷脂转酰酶，但尚不清楚为什么它通过选择性剪接形成多个转录物。在这里，我们研究了人类tafazzin的四种亚型和果蝇tafazzi的三种亚型在不同哺乳动物和昆虫系统中表达时的细胞定位、酶活性和代谢功能。当在HeLa细胞中表达时，除了与多个细胞内膜相关的B型果蝇tafazzin外，所有异构体都定位在线粒体中。在人类亚型中，只有全长塔法齐蛋白（FL）和缺乏外显子5的塔法齐素（Delta5）具有转酰基转移酶活性，只有这两种亚型能够恢复正常的心磷脂模式、线粒体的正常呼吸活动和塔法齐缺乏果蝇的雄性生育能力。FL和Delta5都与293T细胞线粒体中的大蛋白复合物有关，但用碱和蛋白酶K处理表明，Delta5亚型比FL亚型更能整合到膜的疏水核心中。尽管所有果蝇亚型在体外均显示转酰酶活性，但只有A型支持果蝇的心磷脂重塑。数据表明，人类表达了两种tafazzin的线粒体同工酶，它们具有相似的转氨酶活性，但膜拓扑不同。此外，数据表明，人类tafazzin在苍蝇中的表达产生了果蝇模式的心磷脂，这表明心磷脂的特征脂肪酸谱不是由tafazzine的底物特异性决定的。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**来自人类和*果蝇属*.**示意图显示了塔法赞蛋白亚型与灰色和中的疏水段*黑色。果蝇属*tafazzins因其N端可变区而异。人类tafazzins因外显子5和7的存在/缺失而不同。

**图2。**
**tafazzin亚型的细胞内定位。**用表达HA标记的tafazzin亚型的质粒转染HeLa细胞。共聚焦显微镜下，细胞用HA抗体染色以显示tafazzin，用MitoTracker染色以显示线粒体。

**图3。**
**dTAZ-B的细胞内定位。**用表达HA标记dTAZ-B的质粒转染HeLa细胞，然后通过共焦显微镜进行分析。比较了dTAZ-B在细胞内的分布和线粒体的分布(A类)内质网(B类)和高尔基器械(C类). 针对*果蝇属*tafazzin在纯化后的样品中检测到两条带*果蝇属*膜。与dTAZ-B对应的带仍然存在于ΔTAZ突变体中(天).重量，野生型。

**图4。**
**tafazzin异构体的跨酰酶活性。**在Sf9昆虫细胞中表达不同的tafazzins，分离线粒体，并在不同的检测系统中测定转氨酶活性。用野生型杆状病毒转染作为对照(无). 基板对包括16:0-[¹⁴C] 18:2-PC+单核细胞-CL(A类)，CL（牛心）+溶血素-[¹⁴C] 个人电脑(B类)，PC（具有指定的酰基）+溶血素-[¹⁴C] 个人电脑(C类)，16:0-18:2-磷脂酰甘油+溶血素-[³H] 磷脂酸(*PA公司*) (D类)和16:0-18:2-PC+lyso-[¹⁴C] 个人电脑(E类).

**图5。**
**tafazzin亚型在ΔTAZ中的转基因表达*果蝇属*.**从苍蝇菌株KG02529中不精确地切除P元件，产生了dTAZ-A（ΔTAZ）缺失的苍蝇（12）。然后，在ΔTAZ突变体（ΔTAZ+插入物）中表达塔法赞蛋白的各种亚型。这个图通过攀爬实验显示了各种转基因苍蝇菌株的运动功能。在该分析中，苍蝇种群根据其攀爬活动分布在七个试管之间。1号管中的苍蝇攀爬活动最低，7号管中苍蝇的攀爬活动最高。

**图6。**
**转基因蝇株的表型。**从蝇类菌株KG02529中切下P元件，产生任意一种野生型苍蝇(重量或dTAZ-A缺失的苍蝇（ΔTAZ，P元素切除不精确）（12）。然后，在ΔTAZ突变体（ΔTAZ+插入物）中表达塔法赞蛋白的各种亚型。A类，男性生育率被量化并表示为野生型生育率的百分比。B类，在ADP和琥珀酸存在下测量分离线粒体的呼吸活性，并以野生型活性的百分比表示。C类，CL通过MALDI-TOF质谱分析，并且（16:1）的量₂（18:2）₂-CL用内标物定量（14:0）₄-修正后的CL¹³C同位素效应（20）。D类，68:4-CL的比例(米/*z（z）*=1400）大于68:6-CL(米/*z（z）*=1396），根据修正后的II型MALDI-TOF质谱测定¹³C同位素效应（20）。

**图7。**
**C类₆₈-各种CL物种*果蝇属*菌株。**线粒体脂质提取物采用MALDI-TOF质谱分析。该图显示了包含C的光谱区域₁₆-C类₁₆-C类₁₈-C类₁₈-野生型苍蝇的CL种(重量)、tafazzin突变果蝇（ΔTAZ）和几个在ΔTAZ+背景中表达tafazzi亚型的转基因果蝇（△TAZ+）。*红色箭头*将峰值标记为米/*z（z）*= 1396 ((16:1)₂(18:2)₂-CL、，即重塑CL），以及*绿色箭头*将峰值标记为米/*z（z）*=1400（主要是16:0-16:18-18:1-18:2-CL，即非重塑CL）。

**图8。**
**hTAZ-Δ5和hTAZ-FL的复合物形成和膜结合。** *A–C*hTAZ-Δ5和hTAZ-FL的HA标记结构在293T细胞中表达。分离线粒体并用洋地黄素溶解，用BN-PAGE分离溶解蛋白，然后用考马斯染色(A类)或用HA抗体进行Western blot分析(B类和C类). 对应于呼吸复合物III的蛋白质带₂显示了、IV和V。天用碱（0.1）处理分离的线粒体米氯化钠₃)用Western blot法测定塔法赞的释放，并用密度分析法定量。

**图9。**
**293T细胞线粒体的蛋白酶K处理。**hTAZ-Δ5和hTAZ-FL的HA标记结构在293T细胞中表达，分离线粒体并在不含或含有洋地黄蛋白（1 g/g蛋白）或Triton X-100（0.1%）的情况下用蛋白酶K（0、20、200 ng/ml）处理。用蛋白质印迹法分析样品中的塔法赞(哈)，线粒体孔蛋白(*VDAC公司*)和复合物I的亚单位NDUS3(*CoI公司*).

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