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.2009年10月2日;8(10):1242-9.
doi:10.1016/j.dnarep.2009.07.008。 Epub 2009年8月21日。

FEN1在维持线粒体DNA完整性中作用的证据

附属公司

FEN1在维持线粒体DNA完整性中作用的证据

利扎·卡利法等。 DNA修复(Amst). .

摘要

尽管负责基因组DNA复制和修复的核过程特征明确,但线粒体DNA(mtDNA)复制和修复所涉及的途径仍不清楚。由于细胞器极易积累氧化性DNA损伤,DNA修复在线粒体隔室中尤为重要。据推测,线粒体DNA损伤的持续积累和随后的突变可能在细胞衰老中起作用。线粒体碱基切除修复(mtBER)在对抗线粒体DNA氧化损伤中起主要作用;然而,参与mtBER的蛋白质尚未完全鉴定。已经确定,在核长补片(LP)BER期间,FEN1负责DNA合成过程中产生的5'瓣结构的断裂。此外,在哺乳动物细胞系的线粒体提取物中观察到5’瓣的去除;然而,FEN1的线粒体定位尚未明确证实。在本研究中,我们分析了删除酵母FEN1同源物RAD27对酿酒酵母mtDNA稳定性的影响。我们的研究结果表明,Rad27p/FEN1定位于酵母和小鼠的线粒体隔室中,并且Rad27p在维持线粒体DNA完整性方面具有重要作用。

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数字

图1
图1
用红霉素耐药性(E)测量DNA点突变随时间的累积R(右))mtDNA和卡那凡尼耐药(CanR(右))核DNA。(A) E的平均中值频率R(右)每107单元格是以天为单位绘制的。每一点代表2-7个独立实验的平均值,每个实验有5-10个培养基,除了17天和21天的时间点雷达27-Δ,其中数据点由一个实验表示,因为所有其他实验的菌落太多,无法准确计数。误差线表示SEM。(B)Can的平均中值频率R(右)每108单元格是以天为单位绘制的。实验用10-20个独立培养物进行了两次。给出了一个具有代表性的实验。野生型菌株由雷达27-Δ应变表示为△.
图2
图2
核和线粒体直接重复介导缺失(DRMD)报告。(A) 核DRMD报告人包括URA3公司基因插入99 bpTRP1号机组基因后面跟着整个TRP1号机组缺乏ATG的基因。(B) 线粒体DRMD报告子包括阿根廷8国集团基因插入99 bpCOX2型基因后面跟着整个COX2型如前所述缺乏ATG的基因[7]。实心方框表示96 bp的直接重复序列。(C) 野生型和RAD27型缺陷酵母按对数标度绘制。误差条表示SEM。
图3
图3
报告者构建用于测量线粒体微卫星不稳定性(A)参数8::(GT)16+1[39]和(B)参数8::(GT)16+2 [6].阿根廷8国集团是的导数阿根廷8国集团根据线粒体的密码子偏好进行修饰。该基因已被插入线粒体基因组5′COX2型基因的转录和翻译信号COX2型.二核苷酸(GT)16序列已插入9 bp参数8每个记者的血压为32个基点。侧翼序列已被更改,以生成+1和+2移码。(C) 线粒体微卫星不稳定性对RAD27型与野生型相比,缺乏菌株。每10帧移动的平均中位数频率7绘制单元格。误差条表示SEM。
图4
图4
Rad27p定位于酵母线粒体体内(A)野生型荧光显微镜,RAD27型-GFP、,ABF2型-GFP和NLS-GFP酵母在含有2%甘油(Sgly)的合成培养基中生长,以选择用于呼吸细胞。酵母用1X PBS洗涤,用DAPI和Mitotracker染色,并用DIC、DAPI、德克萨斯红和GFP过滤器观察。(B) 野生型和RAD27型-生长在Sgly Complete中的HA酵母菌株。车道:1–野生型全细胞提取物;2 –RAD27型-HA全细胞提取物;3–野生型粗线粒体部分;4 –RAD27型-HA粗线粒体部分;5–野生型纯线粒体部分;6 -RAD27型-HA纯线粒体部分。用抗Por1p和抗Cox3p作为线粒体富集的对照,用抗HA作为Rad27p,用抗组蛋白H4作为核对照。(C) 蛋白酶消化雷达27-HA粗线粒体测定亚线粒体定位。通道:1–模拟处理的线粒体;2-蛋白酶K处理的线粒体;3-模拟处理的有丝分裂体;蛋白酶K处理的有丝分裂体;5–蛋白酶K处理破裂的线粒体。用抗-HA检测Rad27p、抗Cox2p、抗Cit1p和抗Por1p的印迹。除抗-HA斑点外,所有斑点代表每条车道20μg样本,每条车道包含100μg样本。
图5
图5
FEN1定位于小鼠线粒体。(A)从大脑、心脏和肾脏分离小鼠线粒体并进行SDS-PAGE。对于每种组织类型,通道1包含核材料和未破碎细胞,通道2包含细胞质材料,通道3代表纯化的线粒体。用抗VDAC检测线粒体含量,用抗组蛋白H4检测细胞核含量,并用抗FEN1检测印迹。(B) 小鼠脑线粒体蛋白酶K消化。第1道-全组织匀浆;2-胞浆;3-纯化线粒体;4–8–线粒体用蛋白酶K处理指定时间(分钟)。用抗FEN1抗体、抗VDAC抗体检测OMM蛋白,用抗细胞色素C检测线粒体膜间隙蛋白的释放,用抗组蛋白H4作为核污染的对照。

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引用人

工具书类

    1. 华莱士特区。人和鼠的线粒体疾病。科学。1999;283:1482–1488.-公共医学
    1. 玻尔VA.修复核和线粒体DNA中的氧化DNA损伤,以及哺乳动物细胞中随年龄增长的一些变化。自由基生物医学,2002年;32:804–812.-公共医学
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    1. Trifunovic A、Wredenberg A、Falkenberg M、Spelbrink JN、Rovio AT、Bruder CE、Bohlooly-Y M、Gidlof S、Oldfors A、Wibom R、Tornell J、Jacobs HT、Larsson N-G。表达线粒体DNA聚合酶缺陷的小鼠过早衰老。自然。2004;429:417–423.-公共医学
    1. Zhang H、Chatterjee A、Singh KK。酿酒酵母聚合酶Zeta在线粒体中的功能。遗传学。2006;172:2683–2688.-项目管理咨询公司-公共医学

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