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.2009 10月29日;28(43):765-74。
DOI:101038/ONC.200。 EPUB 2009 8月17日。

端粒酶和ALT永生化的基因表达标记揭示hTERT调控网络,提示间充质干细胞起源于ALT。

附属
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端粒酶和ALT永生化的基因表达标记揭示hTERT调控网络,提示间充质干细胞起源于ALT。

克拉菲蒂怀特等。 癌基因. .
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摘要

端粒长度由两种已知的机制维持,端粒酶的激活或端粒的交替延长(ALT)。调节ALT表型的分子机制知之甚少,如何在细胞水平上决定激活哪种途径尚不清楚。我们已经表明,通过启动子的染色质重塑来抑制端粒酶基因表达是调节的一种机制,然而,可能需要其他基因和信号网络来调节端粒酶并维持ALT表型。使用基因表达谱,我们发现了1305个基因的签名,以区分端粒酶阳性和ALT细胞系。通过将其与脂肪肉瘤组织样本的基因表达谱相结合,我们将此签名细化为297个基因。在该签名中的基因之间已知的相互作用的网络分析揭示了一种与ALT细胞系和脂肪肉瘤中的人端粒酶逆转录酶(hTERT)抑制模型一致的调节信号网络。该网络扩展了我们现有的hTERT调控知识,并提供了一个平台来了解hTERT在不同肿瘤类型和正常组织中的差异调节。我们还展示了一种新的间充质干细胞起源于细胞系和间充质组织中ALT永生化的证据。

数据

图1
图1
ALT和端粒酶阳性细胞系的基因表达分析(a)盒状图显示ALT和端粒酶阳性细胞系中正常化数据的分布。灰盒定义了25和75%个四分位数,而误差条表示分布的第一和第九十九百分位数。点代表离群值,黑线表示中值,而交叉代表分布的平均值。(b)来自细胞系和脂肪肉瘤组织样本的签名生成概述。从1305个基因细胞系签名和6719个基因脂肪肉瘤特征的组合中产生一个精制的297个基因特征。这一特征显示了一个潜在的间充质干细胞起源于ALT,并参与端粒酶基因调控。NCBI GEO提交的基因表达数据HTTP://www. NcBi.nL.NIH.GOV/GEO/)注册号为GSE14533。
图2
图2
基因表达谱区分端粒酶阳性和ALT细胞系,提示间充质干细胞起源于ALT.(A)散点图,其代表ALT(蓝色)和端粒酶阳性(红)细胞系中的1305个基因标志的归一化微阵列表达值相对于总体中值表达值。每个点代表基因的平均基因表达值,而误差条代表标准误差。(b)使用SPAREMAN相关性、平均连锁和合并分支进行的细胞系数据的分层聚类,使用0.001个签名使用1305个签名精确地分离端粒酶阳性(红色)与ALT(蓝色)细胞系。(c)端粒酶阳性(红色)和ALT(蓝色)细胞系、正常成纤维细胞(紫色)和HMSC(绿色)的分层聚类,使用SPARMAN相关、平均连锁和合并分支与0.001或更少的相似性相关与1305基因签名。
图3
图3
1305基因表达标记的验证突出了干细胞连接。(a)在端粒酶阳性细胞系5637、A27 80、C33 A和HT1080(黑条)和ALT细胞系Wi33-Sv40、KMST6、SKLU、SUM1(灰棒)细胞系中,通过定量PCR验证DSC54、WNT5B、MYEOV和NSUN5的表达水平。每个棒代表从标准化实验到GAPDH的三重反应的平均值和标准误差。(b)从公开的微阵列表达数据中提取的各种正常组织中DSC54、WNT5B和MYEOV的表达值,与ALT和端粒酶阳性细胞系和HMSC的表达值比较。点表示中值,而误差条表示最大和最小归一化表达式值。
图4
图4
ALT和端粒酶阳性脂肪肉瘤和HMSC的分层聚类区分端粒酶阳性的ALT和突出的HMSC起源ALT。以前的脂肪肉瘤样品被确定为ALT(蓝色)或端粒酶阳性(RED)的经典方法。这些样本和HMSC(Green)的分层聚类是使用SPAREMAN相关、平均连锁和合并分支进行的,其相似性相关性为0.001或更少,使用(a)所有基因(b)1305基因签名或(c)精制的297基因签名。(d)297个基因签名的网络分析显示hTERT调节。通过使用Meta分析网络构建算法绘制的297个基因签名的基因之间已知的直接相互作用的信令网络。绿色箭头表示正、红色负和灰色未指定的相互作用。网络对象旁边的红色和蓝色圆圈表示表达式数据。红:ALT和AT端粒酶阳性脂肪肉瘤标本和细胞系;蓝色:ALT下降,端粒酶阳性的脂肪肉瘤样本和细胞系。该网络强调,c-myc激活的一些分子在ALT细胞中表达减少,而c-myc抑制的分子在ALT细胞中表达增加。这提示在使用ALT的细胞中c-Myc活性降低。
图5
图5
在蛋白质水平上显示了TATR调控网络,并且预测c-Myc活性在ALT中被显著地降低(A)Western印迹显示3个基因的297个基因网络中的蛋白质水平差异。将15μg的细胞提取物在NIPAGE 4-12%双TIS凝胶上运行,转移到微孔微孔硝酸纤维素膜上,并用合适的抗体进行检测。然后用Erk1负荷控制对印迹进行剥离和复查。面板显示2个单独的印迹代表性的面板。(b)c-myc活性ELISA显示ALT细胞活性显著降低。间隔图显示了6个ALT细胞系(Wi33-Sv40、KMST6、SKLU、SUM1、SAOS和U2OS)和4个端粒酶细胞系(A27 80、C33 A、HT1080和5637)的平均3个不同的时间,每个细胞系有4个重复。十字线表示每个组的平均表达式,误差条显示平均值的95%置信区间。t检验值t==2.51 p-值=0.015 dF=51。

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