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.2009年8月5日；29(31):9903-17.
doi:10.1523/JNEUROSCI.0813-09.2009。

快速发作性神经退行性变中逆行信号从生存到应激的转换

埃兰·珀尔森 1, Goo-Bo Jeong先生, 珍妮·罗斯, 拉姆·迪克西, 凯伦·华莱士, 罗伯特·G·卡尔布, Erika L F Holzbaur公司
附属公司

快速发作性神经退行性变中逆行信号从生存到应激的转换

埃兰·珀尔森等。 神经科学. .

摘要

由动力蛋白驱动的细胞信号的逆行轴突运输对神经元的存活至关重要。逆行运输机制缺陷的小鼠模型，包括Loa小鼠（动力蛋白的点突变）和Tg（动力蛋白）小鼠（动力蛋白过度表达），表现出轻微的神经退行性疾病。在更快速进行的神经退行性变中也观察到了转运缺陷，例如在家族性肌萎缩侧索硬化症（ALS）的SOD1（G93A）转基因小鼠模型中观察到的转运缺陷。在这里，我们检验了逆行信号改变导致神经退行性变的假设。体内、体外和活体细胞成像运动分析显示，SOD1（G93A）模型中的转运和逆行信号的抑制受到了错误调节。然而，在Loa和Tg（动力蛋白）小鼠模型中也观察到类似的抑制作用。因此，逆行信号的减慢只会导致轻度退化，无法解释ALS的病因。为了进一步研究这个问题，我们使用蛋白质组学方法来研究动力蛋白相关的逆行信号。这些数据表明，在SOD1（G93A）模型中，逆行生存因子显著减少，包括P-Trk（磷酸化Trk）和P-Erk1/2，逆行应激因子信号增加，包括P-JNK（磷酸化c-Jun N末端激酶）、caspase-8和p75（NTR）裂解片段；Loa鼠标中没有类似的变化。运动神经元和胶质细胞表达突变体SOD1（mSOD1）在分隔室中的共培养表明，抑制逆行应激信号足以阻断细胞应激通路的激活，并将运动神经元从mSOD1-诱导的毒性中解救出来。因此，从促进生存到预防死亡的逆行信号转导可能是ALS神经变性快速发生的关键。

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数字

图1。
图1。
家族性ALS小鼠模型的轴突转运受到明显抑制。A类，对85天龄SOD1的坐骨神经进行双重结扎实验G93A公司（mSOD）和年龄匹配的非转基因窝鼠（n.Tg）小鼠，以及过度表达野生型SOD1（wtSOD）的转基因小鼠。对紧邻结扎部位近端（P）和远端（D）的节段进行Western blot分析，以检测KHC、p150的积累胶水动力蛋白亚基和动力蛋白p50-动力蛋白亚单位；GAPDH作为对照。我们观察到两种逆行性血管内凝血（DIC，p150，p50）的显著差异(第页<0.01）和顺行（KHC）(*第页<0.05）与n.Tg和wtSOD1对照相比的运输。用扫描电镜绘制了三个不同实验中相对于GAPDH的远端和近端强度的平均值。B类,D类，活细胞成像显示表达mSOD1的神经元轴突转运减慢。使用相位光学实时成像监测囊泡转运。表达mSOD1的初级运动神经元逆行运输的平均速度(B类) (n个>40）与表达wtSOD1或未感染（n.Inf）神经元的神经元以及DRG培养物中的神经元进行比较(D类)来自85天龄mSOD1小鼠的神经元与来自同窝对照组（n.Tg）或表达wtSOD1的小鼠培养的神经元的比较(n个>30）表明(第页<0.01）减少。顺行运输的平均速度也显著降低(第页<0.05）在表达mSOD1的MN中(n个>39）和DRG(n个>17）与对照组相比。C类，瞬时速度分布曲线的比较(n个>2000）表明mSOD1的表达不会影响细胞器运动的最大速度，但确实会导致整体速度降低。
图2。
图2。
体外动力蛋白运动功能分析。A类,B类，微管滑动分析示意图(A类)并且在时间序列中(B类)使用从n.Tg（顶部）或mSOD1（底部）小鼠纯化的肌动蛋白。平均速度无差异(n个> 3000). 比例尺，3μm。C类,D类,体外水泡运动测定如示意图所示(C类)和时间序列(D类)使用全内反射荧光显微镜观察mSOD1/M30（mSOD1）和M30（n.Tg）对照小鼠。与n.Tg小鼠相比，从mSOD1纯化的囊泡沿着微管（红色）进行加工运动（箭头）的囊泡数量（绿色；箭头）存在显著差异(*第页< 0.05). 该图表示三个独立实验的平均±SEM。比例尺，5μm。
图3。
图3。
抑制营养因子的逆行运输。A–E、85日龄SOD1坐骨神经双结扎实验G93A公司（mSOD）、6个月贷款和1年Tg动态素进行过表达小鼠（p50）和年龄匹配的对照小鼠，并对结扎部位的近端（P）和远端（D）进行Western blot分析。显著抑制生存因子如P-Trk的逆行转运(A类)、BDNF(B类)、NGF(C类)，Erk1/2(D类)和Erk5(E类)在所有三个模型中都观察到*第页< 0.01.F类在培养自85天龄mSOD1和n.Tg对照小鼠的DRG神经元中观察到NGF-Qdot转运。相位图中的箭头显示运动方向，箭头跟踪代表性的Q点，轴突被假彩色显示为蓝色（n.Tg）或红色（mSOD）。比例尺，5μm。G公司，一个有代表性的波形图显示，表达mSOD1的神经元中NGF-Q点的转运出现更多停顿（箭头）。H（H）瞬时速度的相对频率分布(n个>120）显示出向低速的显著转变。与对照组相比，表达mSOD1的神经元中Qdot-NGF改变运动方向的次数更多(*第页< 0.01).我、NGF-Qdots的平均逆行速度和总游程明显缩短(n个≥ 5; *第页<0.01）（平均速度±SEM）。
图4。
图4。
动力蛋白相关蛋白的蛋白质组学分析表明，mSOD1小鼠的生存和应激信号平衡发生了变化。A类，蛋白质微阵列分析后的动力蛋白下拉分析示意图。B类Dynein下拉框分离与Dynein直接相互作用的蛋白质，如dynactin（p150和p50），或间接相互作用的蛋白，如信号内体成分synaptotagmin、Rab5、P-Erk1/2和P-Trk。相反，细胞溶质蛋白GAPDH在DIC下拉框中不富集。输入，负载分数；PD，DIC或控制（Ctrl）珠的下拉分数；突触，突触蛋白。C类,D类，动力蛋白下拉的蛋白质组学分析总结。生存因素更少(C类)以及更多压力/死亡信号(D类)与对照组相比，发现与mSOD1轴浆提取物中的动力蛋白结合。
图5。
图5。
SOD1中观察到信号蛋白与动力蛋白的差异相互作用G93A公司但与对照组相比，Loa小鼠没有。A–C、85天龄SOD1的坐骨神经提取物G93A公司（S） 在DIC下拉分析中使用12月龄Loa（L）和年龄匹配的n.Tg和野生型（W）小鼠，然后对不同的信号蛋白进行Western blot分析。下拉分析的阳性对照（Post.CTRL）为p150胶合的dynactin的p50（dynamicin）亚基；GAPDH用作阴性对照（阴性对照）。D–F型、P-Trk、P-Erk1/2、P-Erk 5和Bim均显示与SOD1中动力蛋白的相关性降低G93A公司但Loa小鼠没有。G–ISOD1中活化的caspase-8、P-JNK和p75裂解片段与动力蛋白的相关性增加G93A公司但在Loa小鼠中未观察到这些动力蛋白货物的显著变化。PD、DIC下拉；CTRL，控制珠子；CLV，解理；FL，全长；CTF，C末端片段；ICD，胞内结构域；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8。J型,K，在SOD1中观察到囊泡信号蛋白的差异关联G93A公司但与野生型对照组相比，Loa小鼠没有(J型). 对mSOD1、Loa和野生型小鼠的囊泡提取物进行pTrk和p75差异的Western blot分析。突触结合蛋白被用作负荷控制。然而P-Trk水平下降（>75%；第页与对照组相比，mSOD1小鼠囊泡中p75裂解片段增加，Loa小鼠的P-Trk和p75水平与WT对照组相同。印迹来自具有代表性的实验(J型)图为与对照小鼠相比，来自≥3个独立实验±SEM的动力蛋白与特定货物关联的相对变化（1=无相对变化）的平均值(K). S、 汤；P、 颗粒；0.6, 0.6米蔗糖；五、 囊泡提取物；1.5, 1.5米蔗糖；Syn，突触蛋白。
图6。
图6。
表达mSOD1的神经元中信号分子逆行运输和定位的改变。A–C、85日龄SOD1坐骨神经双结扎实验G93A公司（mSOD）、6个月贷款和1年Tg动态素进行过表达小鼠（p50）和年龄匹配的对照小鼠，并对结扎部位的近端和远端进行Western blot分析。压力/死亡因素，如p75裂解碎片(A类)、JNK(B类)，和活化的胱天蛋白酶8（actv-casp8）(C类)仅在mSOD1小鼠中显示逆行轴突运输的改变。P、 近节段；D、 远端。条形图表示三个不同实验中相对于GAPDH的平均强度±SEM。D–G型，大鼠E14胚胎运动神经元感染HSV-wtSOD或HSV-SOD1G85R型并用P-Trk抗体染色(D类)或p75的胞内结构域(E类). 与表达wtSOD1的神经元相比，表达mSOD1运动神经元培养物显示出更少的P-Trk和更多的p75定位于过程（插图中方框区域的放大倍数更高）。比例尺：（inD类)D类,E类，5微米。G公司，染色定量显示p75水平显著升高，pTrk水平显著降低(n个> 30; *第页表达wtSOD1的神经元突起中mSOD1突起中的细胞数量小于0.01）。每单位长度的免疫反应斑点数量也被量化。在mSOD1表达细胞的轴突上，P-Trk阳性的点较少，p75阳性的点较多(n个> 30; *第页< 0.01). 图中所示为平均±SEM。图中还显示了所示区域沿神经突的线扫描分析(F类).H（H）,我,体内小鼠胸骨肌p75和P-Trk运动神经元的免疫染色还显示，在mSOD1轴突中P-Trk表达较少，p75表达较多。比例尺：H（H），50微米；我，5μm。J型，沿轴突定位。mSOD1和wtSOD1小鼠的典型轴突线扫描证实了P-Trk和p75的改变模式。实验重复两次，结果相似。
图7。
图7。
逆行信号的非细胞自主变化导致细胞死亡。E14胚胎大鼠运动神经元在有或无胶质细胞的情况下生长，并感染HSV-wtSOD或HSV-SOD1G85R型.A–F，P-Trk染色减少(A类,C类,D类)表达mSOD1的神经元过程中p75的反应性增加(B类,E类,F类)与胶质细胞共培养的神经元。线扫描比较了在没有（绿色）或有（橙色）胶质细胞的情况下，神经元表达突变或野生型SOD1的过程中的相对信号强度。NF，神经丝。比例尺，5μm。G公司,H（H）与表达wtSOD1的神经元相比，mSOD1表达导致对caspase-3抗体的反应性增强。条形图表示三个独立实验的～100个细胞中含有活化caspase-3的细胞百分比的平均±SEM。与表达mSOD1的胶质细胞共培养的神经元中，caspase-3的激活更为明显(*第页< 0.01). W、 wtSOD1；S、 mSOD1；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3。比例尺，8μm。
图8。
图8。
抑制运动神经元的逆行应激信号足以阻断P-c-Jun的激活，并使运动神经元免受mSOD1诱导的毒性。A类，E14胚胎大鼠运动神经元在分隔的Campeno室中生长3周。将CM-Dill示踪剂添加到远端腔室，以标记将轴突延伸至远端腔室的神经元胞体。将胶质细胞加入远端隔室；MN和胶质细胞均感染HSV-mSOD1或HSV-wtSOD1。在第2天（基础数）和第6天计算活的CM-Dill阳性MN细胞体，并对第6天的存活率进行评分。B类在共培养中，mSOD1的表达在6天后导致显著的细胞死亡（～50%）。在远端腔室中添加JNK、caspase-8和p75的特异性抑制剂，在动态蛋白过度表达的情况下抑制逆行应激信号，导致细胞存活率显著增加(*第页< 0.01).C类,D类MN细胞体对JNK激活下游靶点转录因子P-c-Jun的免疫染色显示mSOD1表达细胞中的激活在体外动力蛋白的动力蛋白（p50）亚单位过度表达对动力蛋白转运的部分抑制可防止P-c-Jun的上调(*第页<0.001），但在第5天之后没有(C类). 然而，添加抑制剂的混合物（到JNK、p75和caspase-8）可以防止P-c-Jun的上调(*第页<0.001）6天后(D类). 实验每次用四个腔室重复两次。对每种情况总共1000多个细胞进行评分。MT，微管。比例尺，20μm。E类Western blot分析显示，与n.Tg对照组（n.Tg）相比，mSOD1小鼠（S）的P-c-Jun上调。Western blot分析重复三次，结果相似，并使用ImageJ进行量化。
图9。
图9。
轴突运输平衡变化与疾病严重程度和时间进程相关的模型：逆行运输减慢是导致运动神经元缓慢进行性退化的早期步骤，因为营养因子信号减弱，如Loa和Tg动态素SOD1显示，在50天（症状前）逆行传输信号的性质发生变化，导致120天（严重症状和疾病晚期）更严重、更迅速的进行性退化G93A公司模型。疾病分期根据体重减轻、行走困难和肌肉萎缩等症状进行分类。SOD1的时间刻度G93A公司如图所示。Sym，症状。
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