The genesis of cerebellar interneurons and the prevention of neural DNA damage require XRCC1

doi:10.1038/nn.2375

.2009年8月；12(8):973-80.

doi:10.1038/nn.2375。 Epub 2009年7月26日。

小脑中间神经元的发生和神经DNA损伤的预防需要XRCC1

李永秀（Youngsoo Lee）¹, 萨钦·卡蒂尔, 杨莉, 谢里夫·埃尔·卡米西, 海伦·R·罗素, 基思·卡尔德科特, 彼得·麦金农

附属公司

PMID： 19633665
预防性维修识别码：项目经理2831284
内政部： 10.1038/nn.2375

小脑中间神经元的发生和神经DNA损伤的预防需要XRCC1

李永秀（Youngsoo Lee）等。自然神经科学. 2009年8月.

.2009年8月；12(8):973-80.

doi:10.1038/nn.2375。 Epub 2009年7月26日。

作者

李永秀（Youngsoo Lee）¹, 萨钦·卡蒂亚尔, 杨莉, 谢里夫·埃尔·卡米西, 海伦·R·拉塞尔, 基思·卡尔德科特, 彼得·麦金农

附属

¹美国田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院遗传学和肿瘤细胞生物学系。

PMID： 19633665
预防性维修识别码：项目经理2831284
内政部： 2010年10月38日/年23月275日

摘要

对DNA单链断裂的不良反应是各种神经退行性疾病的基础。然而，这种修复途径在神经系统发育和维持过程中的确切作用尚不清楚。通过对Xrcc1（修复DNA单链断裂的关键因子）的小鼠神经特异性失活，我们发现了一种以小脑中间神经元缺失为特征的深刻的神经病理学。这种细胞丢失与p53依赖性细胞周期阻滞有关，发生在中间神经元祖细胞开始分化时。Xrcc1缺失还导致神经系统DNA链持续断裂和海马功能异常。总之，这些数据详细说明了DNA单链断裂修复和神经发生之间的体内联系，并突出了神经系统中特定类型的基因毒性应激的不同后果。

PubMed免责声明

数字

**图1。生成*外部协调1*条件鼠标**
(一)Xrcc1示意图，显示BRCT（BRCA1相关C末端）结构域和与DNA修复蛋白相互作用相关的区域。(b）这个*Xrcc1号机组*-目标构造是用*LoxP公司*外显子4至10两侧的位点（具体细节见补充图1a）。**（c）**)Northern杂交分析表明对照动物产生*Xrcc1号机组*转录本（2.5 kb），而*Xrcc1号机组*成绩单不在*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*小脑和大脑皮层。肌动蛋白mRNA（2kb）作为负载对照。(d日)Western blot分析表明Xrcc1蛋白（~80 kDa）在*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*这与Xrcc1相关蛋白DNA连接酶3（~110kDa）水平降低有关。相反*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*动物产生的Xrcc1和连接酶3的量与对照组相当。肌动蛋白被用作加载控制。(**e（电子）**)Kaplan-Meier曲线显示*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*小鼠可以存活4个月。(如果)成年人的比较*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*野生型对照动物显示生长迟缓，突变体动物的大脑较小。(g）对3个月大的对照组和突变组大脑的磁共振成像分析表明，小脑明显受到Xrcc1缺失（白盒）的影响。三维容积分析显示小脑体积减少约30%，以相对单位表示。

**图2。*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*小脑颗粒神经元DNA修复缺陷**
(一)将单细胞小脑悬浮液通过35-60%的percoll梯度，分离界面处的神经元进行实验。(b条)使用新分离的颗粒神经元来确定内源性DNA链断裂*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*小脑（P15）通过碱彗星分析（ACA）。250个单个神经元的彗星数据绘制为平均彗星尾矩（条形图），这些神经元的单个彗星尾力矩显示为散点图。(**c（c）**)*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*电离辐射（20Gy）或100μM H后，小脑颗粒神经元（P7）DNA修复缺陷₂O（运行）₂检查损伤后的不同时期（0分钟[R0]、60分钟[R60]、180分钟[R180]）。ACA后典型受损和修复神经元的显微照片*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*和控制神经元。每个时间点的平均彗星尾矩用条形图表示，30个代表性神经元的尾矩数据用散点图表示。(d日)培养的颗粒神经元对Tuj1（β-微管蛋白III）呈免疫阳性，Tuj1是有丝分裂后神经元的标记（mag.×40）。

**图3。这个*Xrcc1号机组*-大脑缺陷导致成熟神经元DNA损伤**
DNA损伤在不同的*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*出生后第10天（P10）和2个月大时，根据γH2AX病灶（箭头）测量，大脑区域随着年龄的增长而逐渐增加。CTX；大脑皮层；海马齿状回CA1；海马CA1区；浦肯野细胞层。

**图4。中间神经元缺失*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*小脑**
(一)7周龄野生型和*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*钙结合蛋白免疫染色后小脑；突变小脑虽然较小，但其组织学与野生型相似。(b条)不同年龄段的尼塞尔染色显示对照小脑分子层中存在中间神经元（箭头所示），但在对照小脑的分子层中没有中间神经元*Xrcc1号机组^尼斯克*小脑。EGL；外颗粒层，ML；分子层，P；产后一天。(**c（c）**)谷氨酸脱羧酶（GAD）免疫染色确定GABA能神经元（上部面板），这些神经元在*Xrcc1号机组^尼斯克*纸巾（白色箭头）。代谢型谷氨酸受体2（mGluR2）染色（黑色箭头，下部面板）识别颗粒层中的高尔基细胞。Purkinje细胞的Calbindin染色确定野生型小脑和突变型小脑之间Purkinje层的类似组织（黑色箭头）。GCL；颗粒细胞层；Purkinje层。除非另有说明，否则比例尺为200μm。

**图5。分化中间神经元减少*Xrcc1号机组^尼斯克*小脑**
(一)Pax2识别出生后发育的控制小脑白质（WM）中的分化中间神经元（黑色箭头）。这个*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*小脑Pax2阳性细胞自出生时显著减少（P0），到P5时几乎没有中间神经元。相反，脑干中的Pax2阳性细胞未受影响（中间的红色箭头）。(b条)3种不同动物小脑EGL、GCL、WM和P7深核的Pax免疫染色平均定量。星号表示具有统计学意义（±标准偏差）的差异（p<0.05）。(**c（c）**)WM中的Pax3阳性细胞在*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*小脑从出生开始，到第7页就不存在了。在对照组P7小脑中，许多Pax3（红色）阳性细胞与PCNA（绿色）共同染色，但在*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*WM中。然而，Pax3阳性细胞在WT和*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*白色箭头表示Pax3和PCNA免疫阳性的细胞。EGL；外生发层；颗粒细胞层，WM；白质，DN；深核，P；产后一天。DAPI是4,6-二氨基-2-苯基吲哚。比例尺为200μm。

**图6。细胞周期阻滞对DNA损伤的反应*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*小脑**
(一)DNA损伤累积在*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*白质（WM）和深核（DN）（下图），而不是对照组织（上图），如γH2AX形成所示。细胞核用DAPI染色。(b条)P7发育期小脑EGL、IGL、WM和DN中细胞周期（BrdU和PCNA）或凋亡（ssDNA）标记阳性细胞的定量。星号表示具有统计学意义（±标准偏差）的比较（p<0.05）。插图面板显示了每个基因型的免疫组化和用于量化的相应标记。(**c（c）**)尽管γH2AX也在EGL中形成，但与WM相比，TUNEL判断EGL中发生强烈的凋亡，这与γH2AX病灶（下面板）一致。(d日)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3激活发生在P7Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}EGL但不在*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*WM公司。(**e（电子）**)细胞周期阻滞的p53、p21和p27标记物发现于白质中*Xrcc1号机组^尼斯克*出生后发育期间的小脑（箭头）。EGL；外生发层；颗粒细胞层，WM；白质和DN；深核。DAPI是4,6-二氨基-2-苯基吲哚。除另有说明外，比例尺均为200μm。

**图7。中间神经元损失*Xrcc1号机组*-小脑功能缺失依赖于p53**
p53缺失挽救了*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司};第53页^−/−*Nissl和parvalbumin染色显示的小脑（箭头）。相反，通过mGluR2染色（星号）测定，p53缺失对颗粒细胞层（GCL）高尔基中间神经元的恢复效果较差。谷氨酸脱羧酶（GAD）免疫染色显示*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*;第53页^−/−分子层（ML），以及超氧化物歧化酶2（SOD2）免疫染色（箭头所示）。PC是Purkinje细胞层。DAPI是4,6-二氨基-2-苯基吲哚。比例尺为200μm。

**图8。Xrcc1缺失影响海马稳态**
(一)Xrcc1-结合蛋白Parp1的水平在成熟期降低*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*海马（箭头所示）和许多细胞在齿状回（DG）和其他海马区域（如γH2AX病灶所示的CA2区域）积累DNA链断裂。(b条)神经肽Y（NPY）免疫染色在*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*海马体。成人星形胶质细胞增生症*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*海马表现为GFAP和波形蛋白免疫反应增强（箭头所示）。c-Fos免疫反应性的增加表明Xrcc1缺失后海马中的基因表达发生了改变。减少的2,3-环核苷酸3-磷酸二酯酶（CNPase）免疫染色表明少突胶质细胞在*Xrcc1号机组^{Nes-cre公司}*海马体。DG，海马齿状回；CA1，CA2海马CA1和CA2区。DAPI是4,6-二氨基-2-苯基吲哚。除非另有说明，否则比例尺为200μm。

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