The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis

doi:10.1242/dev.034454

.2009年8月；136(16):2767-77.

doi:10.1242/dev.034454。

尖叶极性激酶aPKC作为核决定因子发挥作用，并在爪蟾初级神经发生过程中调节细胞增殖和命运

尼丁·萨伯瓦尔¹, Akiko Tsutsui先生, 莎拉·霍奇, 魏军（Jun Wei）, 安德鲁·查尔默斯, 南希·帕帕洛普鲁

附属公司

PMID： 19633170
预防性维修识别码： PMC2730405型
内政部： 10.1242/开发034454

尖叶极性激酶aPKC作为核决定因子发挥作用，并在爪蟾初级神经发生过程中调节细胞增殖和命运

尼丁·萨伯瓦尔等。开发. 2009年8月.

.2009年8月；136(16):2767-77.

doi:10.1242/dev.034454。

作者

尼丁·萨伯瓦尔¹, Akiko Tsutsui先生, 莎拉·霍奇, 魏军（Jun Wei）, 安德鲁·查尔默斯, 南希·帕帕洛普鲁

附属

¹英国曼彻斯特大学迈克尔·史密斯大楼生命科学学院。

PMID： 19633170
预防性维修识别码： PMC2730405型
内政部： 2014年12月10日/2014年3月3日

摘要

在非洲爪蟾的神经发生过程中，顶端极化的浅层和非极性深层细胞承担着不同的命运：深层细胞成为初级神经元，而浅层细胞作为祖细胞。目前尚不清楚影响细胞极性的蛋白质是否也影响细胞命运，以及膜极性信息如何传递到细胞核。在这里，我们研究了极性成分，即顶部富集的aPKC和基底外侧Lgl2，在原发性神经发生中的作用。我们报道了一种膜栓形式的aPKC（aPKC-CAAX）抑制初级神经发生并促进细胞增殖。出乎意料的是，内源性aPKC和aPKC-CAAX都显示出一些核定位。与核定位信号融合的组成性活性aPKC与aPKC-CAAX具有相同的表型效应，因为它抑制神经发生并促进增殖。相反，以限制在细胞核内的显性负性形式抑制内源性aPKC可增强初级神经发生。这些观察结果表明，aPKC在细胞核中具有一种功能，对初级神经发生期间的细胞命运规范至关重要。在一项补充实验中，基底外侧Lgl2的过度表达导致浅表细胞去极化和内化，当补充神经前因子时，这些细胞会形成异位神经元。这些发现表明，aPKC和Lgl2都影响细胞命运，但aPKC本身是一个核决定因子，可能从细胞膜穿梭到细胞核以控制细胞增殖和命运；Lgl2过度表达导致上皮细胞极性的丧失会改变细胞的位置，并允许改变细胞命运。

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数字

**图1。**
**aPKC过度表达对大鼠原发性神经发生的影响爪蟾**. (A类)各种aPKC的示意图SV40NLS，来自SV40的核定位信号；CAAX，丙酰化信号。(B类)mRNA用于*aPKC公司*（1纳克），*aPKC-CT*（0.5克），*aPKC-CAAX公司*（0.25-0.5克），*NLS-aPKC*（1 ng）和*NLS-aPKC-CT*单方面注射（0.25-0.5 ng）与一起*lacZ公司*mRNA（0.25ng）和胚胎用in分析原位杂交*N-微管蛋白*表达式。仅限*aPKC-CAAX公司*和*NLS-aPKC-CT*对初级神经发生（箭头）。比例尺：250μm。

**图2。**
**aPKC构建体的亚细胞定位和表达。**(A类)切片上使用抗aPKC抗体（绿色）的免疫组织化学显示st.10.5的外胚层爪蟾胚胎（顶端朝上）非注入控制（左）或注入*aPKC-CAAX公司*或*NLS-aPKC-CT*mRNA。箭头表示核染色。(B类)转染HeLa细胞的免疫细胞化学用抗aPKC（红色）和抗GFP（绿色）抗体进行检测。细胞核是蓝色的（DAPI染色）。(C类)用核裂解物进行Western blot分析如图所示，用HA标记的构建物转染HeLa细胞，并用抗aPKC和抗HA-抗体。内源性aPKC显示一些细胞核定位，如抗aPKC抗体所示，但HA-标记aPKC-CAAX如抗HA所示，显示出比HA-aPKC更大的核蓄积抗体。P95和微管蛋白用作核和细胞质对照，分别是。(D类)用核裂解物进行Western blot分析标准10.5爪蟾如图所示，注射HA标记构建物的胚胎并用抗HA和抗aPKC抗体进行印迹。HA-tagged aPKC和aPKC-CAAX显示核聚积。层粘连蛋白和微管蛋白被用作细胞核和细胞质对照。(E类)表达式分析使用HeLa细胞的全细胞裂解物过度表达多种aPKC结构展示。GFP，转染和装载控制。比例尺：50μm in A；B中250μm。

**图3。**
**显性负性aPKC结构过度表达对原发性肝癌的影响神经发生。**(A类)使用的PKC的两种主要负形式。(B类,C类)爪蟾胚胎单侧注射*HA蛋白激酶C NT CAAX*或*NLS-aPKC-NT-HA*mRNA被处理用于（B）用抗HA（绿色）和抗aPKC（红色）抗体，或用于st.16原位杂交的（C）*N-微管蛋白*表达式。而HA-aPKC-NT-CAAX主要表现为NLS-aPKC-NT-HA显示皮质染色伴弱核定位仅核定位（B）。两者过度表达显性负性增强神经发生（C）。箭头指向核染色（B）、异位神经元（C，上排）和表浅异位神经元神经外胚层（C，下一排，中间面板插图）。虚线（C，下一行）指示外胚层和中胚层之间的边界。N、脊索。比例尺：B中为50μm；C中1 mm，上排；C中500μm，下一行。

**图4。**
**过度表达aPKC结构对表皮细胞表达的影响和深层标记。**st.16的整体安装和截面爪蟾胚胎显示原位杂交(A类)的浅表外胚层标记*尿斑蛋白1B*和(B类)深渊外胚层标记*胸腺素α原*.虚线表示外胚层（上图）和中胚层（下图）之间的边界。两个外胚层注入任何一种后，层都会变厚*aPKC CAAX公司*或*NLS-aPKC-CT*mRNA。n个，分析的胚胎总数。比例尺：250μm。

**图5。**
**过度表达aPKC结构对细胞增殖的影响。**(A类)Neurula期爪蟾过度表达aPKC-CAAX和NLS-aPKC-CT显示*N-微管蛋白*表达式和a增厚的外胚层（箭头）。(B类)磷甾酮H3的定量（PH3）-相对于总核数的正核每组至少有三个胚胎，每个胚胎至少有五个切片。(C类)注射aPKC-CAAX和NLS-aPKC-CT的st.10.5胚胎切片与抗PH3共同免疫染色（DIC图像中为黑色，顶行为红色底部行）和抗aPKC（绿色，位于中间和底部行）抗体。切片显示外胚层多层增厚，PH3染色增强外胚层的两层。底部一行显示较高的中间一行放大，抗aPKC和抗PH3。比例尺：250μm in A；50μm（单位：C）。

**图6。**
**过度表达aPKC-CAAX或NLS-aPKC-CT对神经元的影响原肠胚形成期间出生的人口。** 爪蟾胚胎在2细胞期单侧注射PKC-CAAX或NLS-aPKC-CT，BrdU在st.10.5饱和，并对BrdU和st.25尾芽切片上的神经元分化标记物X-MyT1。(A类)顶行显示抗aPKC染色（绿色），细胞核呈蓝色（DAPI），用于区分PKC-CAAX注射侧和非注射侧和NLS-aPKC-CT注射。最下面一行显示相邻部分共染色BrdU（红色）和X-MyT1（绿色）。神经祖细胞仅对BrdU阳性并且出现红色，BrdU标记后出生的神经元被共同标记并出现橙色（箭头），出现st.10.5（BrdU饱和）之前出生的神经元绿色。st.10.5（绿色）之前出生的神经元数量在之后减少任何一种PKC结构的过度表达。圆圈中的虚线描绘神经管和直虚线标志着神经的中线管。(B类)A.结果的量化。

**图7。**
**的影响*液化天然气2*原发性神经发生过度表达。**的过度表达*液化天然气2*（1 ng）对初级神经元标记*N-微管蛋白*(n个=35) (**D-F公司**)由与对照胚胎注射*lacZ公司*仅mRNA（0.25ng、，n个=32) (**A至C**). 但什么时候*液化天然气2*与共同表达前神经原因子*X-ngnr-1号机组*（0.25纳克，n个=26）(**J-L公司**)，异位初级神经元位于中间位置在浅层和深层之间（L，箭头），而胚胎注射具有*X-ngnr-1型*独自一人(n个=41) (**G-I型**)显示异位神经发生仅发生在神经外胚层的深层（I，箭头）。另请注意缺少*lacZ公司*胚胎浅层细胞的染色注入*液化天然气2*和*X-ngnr-1号机组*（L，箭头）具有*lacZ公司*（C）或*X-ngnr-1号机组*（一）注射胚胎，表明Lgl2导致表层细胞内化的可能性过度表达。比例尺：250μm。

**图8。**
**表达Lgl2的细胞内化并参与初级神经发生。**(A类)表达GFPLgl2的细胞在神经突期的内外外胚层爪蟾胚胎通过内化试验进行评估（参见材料和方法详细信息），涉及到表达GFPLgl2的谱系标记个体在囊胚期（a，b）通过注射微量鲁比（Micro-Ruby）获得外细胞。分数内层微红色标记细胞总数标记细胞在*GFPLgl2型*-注射胚胎的比较对照胚胎（c，d）。(B类)胚胎的时间推移图像过表达GFPLgl2，表明在浅表细胞（顶端色素沉着，箭头a）及随后这些细胞在原肠胚中期（g-j）的内化。(C类)收件人确定GFPLgl2过度表达是否导致内化细胞有助于增加神经发生，即基于Micro Ruby的内化检测与原位杂交相结合*N-微管蛋白*，作为对注射于2细胞期*X-ngnr-1号机组*单独或与*GFPLgl2型*（a-f）。条形图显示微红色标记深层细胞相对于标记总数当*GFPLgl2型*联合注射，约76%平均而言，这些细胞*N-微管蛋白*积极的。比例尺：B中500μm；50μm（单位：C）。

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1. Asashima，M.和Grunz，H.（1983年）。诱导剂对非洲爪蟾内外原肠胚外胚层的影响。分化23，206-212。-公共医学
1. Atwood，S.X.和Prehoda，K.E.（2009年）。在成神经细胞不对称分裂期间，aPKC磷酸化miranda以极化命运决定因子。货币。生物学19，723-729。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Bellefroid，E.J.、Bourguignon，C.、Hollemann，T.、Ma，Q.、Anderson，D.J.、Kintner，C.和Pieler，T.（1996）。X-MyT1，一种爪蟾C2HC型锌指蛋白，在神经元分化中具有调节功能。牢房87，1191-1202。-公共医学
1. Betschinger，J.和Knoblich，J.A.（2004）。敢于与众不同：果蝇、秀丽线虫和脊椎动物的不对称细胞分裂。货币。生物14，R674-R685。-公共医学
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[1] Asashima，M.和Grunz，H.（1983年）。诱导剂对非洲爪蟾内外原肠胚外胚层的影响。分化23，206-212。-公共医学

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[7] Betschinger，J.和Knoblich，J.A.（2004）。敢于与众不同：果蝇、秀丽线虫和脊椎动物的不对称细胞分裂。货币。生物14，R674-R685。-公共医学

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