Dioxin receptor deficiency impairs angiogenesis by a mechanism involving VEGF-A depletion in the endothelium and transforming growth factor-beta overexpression in the stroma

doi:10.1074/jbc.M109.013292

.2009年9月11日；284(37):25135-48.

doi:10.1074/jbc。M109.013292。 Epub 2009年7月18日。

二恶英受体缺乏通过内皮中VEGF-a缺失和基质中转化生长因子-beta过度表达的机制损害血管生成

安吉尔·卡洛斯·罗曼¹, 何塞·M·卡瓦贾尔·冈萨雷斯, 伊娃·M·里科·利奥, 佩德罗·费尔南德斯·萨格罗

附属公司

PMID： 19617630
预防性维修识别码：项目经理2757217
内政部： 10.1074/jbc。M109.013292

二恶英受体缺乏通过内皮中VEGF-a缺失和基质中转化生长因子-beta过度表达的机制损害血管生成

安吉尔·卡洛斯·罗曼等。生物化学杂志. 2009.

.2009年9月11日；284(37):25135-48.

doi:10.1074/jbc。M109.013292。 Epub 2009年7月18日。

作者

安吉尔·卡洛斯·罗曼¹, 何塞·M·卡瓦贾尔·冈萨雷斯, 伊娃·M·里科·利奥, 佩德罗·费尔南德斯·萨格罗

附属

¹西班牙巴达霍斯埃斯特雷马杜拉大学Ciencias学院分子生物学系，06071。

PMID： 19617630
预防性维修识别码：项目经理2757217
内政部： 10.1074/jbc。M109.013292

摘要

血管生成在癌症等人类疾病的发展和进展中起着关键作用。因此，鉴定血管生成的新标志物和调节因子是一项关键任务。二恶英受体（AhR）有助于血管内稳态和内皮细胞对毒素的反应，尽管其机制基本上没有特征性。在这里，我们发现AhR-null小鼠（AhR（-/-））体内血管生成受损，从而影响肿瘤异种移植生长。主动脉环迁移实验和RNA干扰表明，AhR（-/-）内皮细胞未能分支并形成管状结构。这种表型被发现是血管内皮生长因子（VEGF）依赖性的，因为AhR（-/-）主动脉内皮细胞（MAECs）分泌的活性VEGF-a量较低，并且用VEGF-治疗可以在培养和体内挽救血管生成。此外，在AhR（+/+）MAEC中添加抗血管内皮生长因子抗体可减少血管生成。在低氧条件下用2-甲氧基雌二醇治疗表明，HIF-1α以AhR依赖的方式调节内皮细胞VEGF的表达。重要的是，AhR-null基质肌成纤维细胞产生增加的转化生长因子-β（TGF-beta）活性，抑制人类内皮细胞（HMECs）和AhR（-/-）小鼠的血管生成，而HMECs与AhR-肌成纤维纤维细胞或其条件培养基共培养抑制分支，通过抗TGFβ抗体恢复。此外，VEGF和TGF-β活性协同调节血管生成，因为在AhR（-/-）MAEC中添加TGF-α进一步降低了其低基础VEGF-A活性。因此，AhR通过一种需要内皮中VEGF激活和基质中TGF-β失活的机制调节血管生成。这些数据强调了AhR在心血管稳态中的作用，并表明该受体可能是肿瘤发展过程中血管生成的新调节器。

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数字

**图1。**
*阿赫勒*^−/−小鼠肿瘤生长受损，血管生成效率低下。 A类，B16F10小鼠黑色素瘤细胞皮下注射于*阿赫勒*^+/+和*阿赫勒*^−/−移植后7天和14天收集小鼠肿瘤。肿瘤体积按长度×宽度计算²× 0.4.B将肿瘤固定、切片并用苏木精和伊红染色，或用内皮标记物CD31抗体通过免疫荧光检测血管。在每个时间点对血管进行计数，并显示14天时与肿瘤对应的结果。请注意，苏木精和曙红图像出现*黑暗的*因为B16F10黑色素瘤细胞表达高水平的黑色素。C类，制备Matrigel并在其背部皮下注射*阿赫勒*^+/+和*阿赫勒*^−/−老鼠。7天后，取下形成的Matrigel塞，清洗并拍照，通过测量血红蛋白含量来量化每个基因型中招募的血管生成。100 mg Matrigel中的血红蛋白含量表示为mg/ml。光学显微镜在室温下在配备有尼康L16相机的尼康E-400显微镜上进行。在Eukitt安装的截面上使用了一个×10物镜（0.25数字孔径）。在配备尼康DS-5 M数码相机的尼康TE2000U显微镜上于室温下进行免疫荧光。在Mowiol-mounted切片上使用×10物镜（0.25数字孔径）。数据显示为平均值±S.D.在五名患者的两侧诱发肿瘤*AhR公司*^+/+和*阿赫勒*^−/−每个时间点的老鼠。在每个基因型的至少四只动物中重复进行Matrigel塞。

**图2。**
*阿赫勒*^−/−小鼠内皮细胞在主动脉环外植体中的小管生成和分支潜能降低。 A类，用于计算主动脉环外植体和Matrigel塞中TTL和分支点的方法的示意图。分支点表示为*箭头所示。B*，戒指是从*阿赫勒*^+/+和*阿赫勒*^−/−小鼠并放置在Matrigel插头中。在培养7天后，通过测量主要发芽血管的TTL来确定试管形成，如所述（47）。最大外生长也被确定为小鼠内皮细胞（MAEC）从主动脉环移出的总距离(*应收账*).C类用4,6-二氨基-2-苯基吲哚染色主动脉环，分析导管形成情况。导管形成是指导管定向/分散内皮细胞之间的比率。在配备尼康L16相机的尼康E-400显微镜上，在室温下进行光学显微镜检查。使用的目标是：×4（0.10数值孔径）(A类)和×10（0.25数字光圈）(B和C类). 数据显示为平均值±S.D。对每个基因型的不同小鼠至少15个主动脉环进行了分析。

**图3。**
**小鼠和人主动脉内皮细胞中AhR表达下调可减少分支和管状结构的形成。** A类，通过分离从主动脉环迁移的内皮细胞获得原代MAEC培养物。细胞被置于Matrigel中，24小时后对分支进行定量。B，视网膜分离自*阿赫勒*^+/+和*阿赫勒*^−/−3天大的新生小鼠，并用异凝集素B4-FITC染色以标记血管。确定并绘制每个基因型的分支点。在视网膜中心的视神经附近进行测量。C类用AhR siRNA或非特异性干扰RNA通过核孔转染HMEC-1细胞，72 h后用Western免疫印迹法测定AhR蛋白水平。β-actin的表达被用作RNAi的阴性对照和Western blotting的负荷对照。D类，将siRNA-或加扰RNA转染的HMEC-1细胞接种在Matrigel中。按照“实验程序”中的描述，在24小时后分析试管的形成和分支。“E类用craft或AhR siRNA转染HMEC-1细胞48或72小时后测定细胞活力。细胞用结晶紫染色并计数。F类，HMEC-1细胞被打乱或AhR siRNA转染并生长融合。添加无血清培养基，按照“实验程序”进行伤口愈合。“数据表示两种实验条件下伤口闭合的程度。在配备尼康L16相机的尼康E-400显微镜上，在室温下进行光学显微镜检查。使用的目标是：×10（0.25数值孔径）(A类和D类)和×20（0.40数字光圈）(B). 数据显示为从不同小鼠分离的主动脉环中获得的至少五种原代MAEC培养物的平均值±S.D.分支分析。从三只眼睛中分离出视网膜*阿赫勒*^+/+和*阿赫勒*^−/−老鼠。用AhR siRNA或非特异性干扰RNA三次转染HMEC-1细胞。*校准棒*对应于100μm。

**图4。**
*阿赫勒*^−/−MAEC降低了促血管生成因子VEGF的表达和活性。 A类，总RNA纯化自*阿赫勒*^+/+和*阿赫勒*^−/−MAEC并用于分析*Hif-1型*α,*素食-A*,*素食-B*,*Plgf公司*,*素食主义者-1*、和*素食者-2*实时RT-PCR表达。基因表达通过*Gapdh公司*表达式。*折叠更改*表示*AhR公司*^−/−MAEC和*阿赫勒*^+/+MAEC。用于扩增每个基因的寡核苷酸序列如表1所示。在至少三种MAEC培养物中进行一式三份的测定。B，mRNA表达*维格夫₁₂₀*,*维格夫₁₆₄*、和*维格夫₁₈₈*通过实时RT-PCR测定亚型。之间的表达差异*阿赫勒*^−/−和*阿赫勒*^+/+MAEC表示为-折叠变化。用于扩增每个基因的寡核苷酸序列如表1所示。C类、分泌的VEGF-A活性量*阿赫勒*^+/+和*阿赫勒*^−/−用ELISA法在条件培养基中检测每种细胞类型和基因型的MAEC和成纤维细胞。D类，模拟缺氧*阿赫勒*^+/+和*阿赫勒*^−/−100μ处理MAEC培养物米氯化钴₂持续16或24小时，以及*维格夫*在mRNA水平上测定表达，如“实验程序”所示。“数据被归一化，并表示为相对于溶剂（DMSO）处理的培养物的倍变化。在一些实验中，MAEC与100μ米氯化钴₂和5μ米2-Me E2在缺氧条件下24小时诱导HIF-1α降解。*维格夫*用β-actin代替*Gapdh公司*避免氯化钴的潜在影响₂关于后一种基因的表达。在三种MAEC培养基中进行了三次实验。数据显示为平均值±S.D。

**图5。**
**siRNA降低AhR下调*Hif-1型*α和*素食-A*HMEC-1细胞中的表达。** A类，HMEC-1细胞通过核穿孔转染AhR-特异性siRNA干扰。对总RNA进行纯化和分析*Hif-1型*α和*素食-A*使用表1所示的寡核苷酸通过实时RT-PCR进行mRNA表达。数据进行了标准化，并且*褶皱变化*代表了干扰和AhR siRNA转染培养物之间的差异。B，HMEC-1细胞转染如A类，一些培养物用5μ米2-Me E2。对总RNA进行纯化和分析*维格夫₁₆₅*mRNA表达如图4图例所示。实验在两种不同的转染中进行，使用三份样品。数据显示为平均值±S.D。

**图6。**
**VEGF活性以AhR依赖的方式调节血管生成体内文化方面。** A类，主动脉环(*应收账*)来自*阿赫勒*^+/+和*阿赫勒*^−/−小鼠，并在Matrigel栓中接种7天。通过测量所述的TTL来分析MAEC的萌发（47）。在一些实验中，*阿赫勒*^+/+或*阿赫勒*^−/−用抗VEGF-A抗体（200 ng/ml）或重组VEGF-A处理主动脉环₁₆₄蛋白质（100 ng/ml）。光学显微镜在室温下使用配备有10倍物镜（0.25数字孔径）的尼康L16相机的尼康E-400显微镜进行。实验在至少10个不同的主动脉环上进行*阿赫勒*^+/+和*AhR公司*^−/−老鼠。*放大的图像*显示在主面板下方。B，将Matrigel塞注射到*阿赫勒*^+/+或*阿赫勒*^−/−小鼠，未经治疗或用抗VEGF-A抗体（200 ng/ml）或重组VEGF-A-治疗₁₆₄蛋白质（300 ng/ml）。通过测量其血红蛋白含量来定量Matrigel塞的血管补充。100 mg Matrigel中的血红蛋白含量以mg/ml表示。对于每个基因型和实验条件，至少使用来自不同小鼠的八个主动脉环。每个基因型的四只小鼠用于体内Matrigel实验。每只小鼠的一侧未经治疗作为对照，另一侧按指示进行治疗。数据显示为平均值±S.D。

**图7。**
**人内皮细胞HMEC-1与*阿赫勒*^−/−成纤维细胞抑制试管形成。**(A类，方案显示了用于HMEC-1细胞与成纤维细胞共培养的实验系统。B，将生长在Matrigel塞中的HMEC-1细胞与*阿赫勒*^+/+或*阿赫勒*^−/−成纤维细胞，其形成试管的能力通过测量TTL来确定（47）。C类，HMEC-1细胞在Matrigel培养基中培养(*C.米*.）由*阿赫勒*^+/+或*阿赫勒*^−/−成纤维细胞，TTL测定同上。光学显微镜在室温下在配备有Nikon L16相机的Nikon E-400显微镜上进行，该相机具有×10物镜（0.25数值孔径）。在每种实验条件下，在四种HMEC-1培养基中进行实验。数据显示为平均值±S.D。

**图8。**
**将重组转化生长因子β或中和抗转化生长因子β抗体添加到通过*阿赫勒*^−/−成纤维细胞调节HMEC-1细胞的血管生成。** A类，的表达式*T细胞生长因子*β-1,*T细胞生长因子*β-2、和*T细胞生长因子*β-三亚型分析*阿赫勒*^+/+和*阿赫勒*^−/−使用表1所示的寡核苷酸通过实时RT-PCR检测成纤维细胞。潜在和活性TGFβ-1和TGFβ-2蛋白的分泌*阿赫勒*^+/+和*阿赫勒*^−/−培养基中的成纤维细胞通过特定ELISA测定，如“实验程序”所示。“为了激活潜在的转化生长因子β，条件培养基在室温下处理10分钟，165米米HCl，然后用NaOH中和。BHMEC-1在Matrigel中电镀，并用来自*阿赫勒*^+/+或*阿赫勒*^−/−成纤维细胞，带有*阿赫勒*^+/+CM加10 ng/ml重组TGFβ，或*阿赫勒*^−/−CM加1μg/ml中和抗TGFβ抗体(抗体). TTL的测定如图所示（47）。光学显微镜在室温下使用配备有10倍物镜（0.25数字孔径）的尼康L16相机的尼康E-400显微镜进行。在每种实验条件下，在三种HMEC-1培养基中进行实验。数据显示为平均值±S.D。C类，在与用于*B、D类*，HMEC-1细胞在用于B。在至少两种不同的HMEC-1培养基中进行三次测定。数据显示为平均值±S.D。

**图9。**
**培养基条件*阿赫勒*^−/−成纤维细胞抑制HMEC-1细胞的侵袭，VEGF和TGFβ水平的调节影响血管募集体内.** A类，在Matrigel-coated Transwells中电镀HMEC-1细胞，用来自*阿赫勒*^+/+或*阿赫勒*^−/−成纤维细胞，带有*阿赫勒*^+/+CM加10 ng/ml重组TGFβ，或*阿赫勒*^−/−CM加1μg/ml中和抗TGFβ抗体(抗体). HMEC-1侵袭通过共焦显微镜进行定量，每5μm进行一次测量。共焦显微镜是在蔡司LSM 510仪器上在室温下进行的。每个基因型和实验条件下至少使用三个Transwell。B，Matrigel塞被注射到*阿赫勒*^+/+或*阿赫勒*^−/−小鼠，未经治疗或用重组TGFβ（10 ng/ml）治疗(*阿赫勒*^+/+小鼠），中和抗TGFβ抗体（1μg/ml）(*阿赫勒*^−/−小鼠），重组TGFβ（10 ng/ml）加上抗VEGF-A抗体（200 ng/ml(*阿赫勒*^+/+小鼠），或中和抗TGFβ抗体（1μg/ml）加重组VEGF-A₁₆₄蛋白质（300纳克/毫升）(*阿赫勒*^−/−老鼠）。7天后，取出塞子并拍照，通过测量其血红蛋白含量来量化血管形成。100 mg基质胶中的血红蛋白含量以mg/ml表示。在每个基因型的至少四只小鼠中重复实验。每只小鼠的一侧作为未经处理的对照，另一侧按指示处理。C类,*阿赫勒*^+/+和*阿赫勒*^−/−MAEC未经处理或分别用中和抗TGFβ抗体（1μg/ml）或重组TGFβ（10 ng/ml）处理。如图4图例所示，通过ELISA测定这些细胞分泌的VEGF-A活性。数据显示为平均值±S.D。

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二恶英受体缺乏通过内皮中VEGF-a缺失和基质中转化生长因子-beta过度表达的机制损害血管生成

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