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.2009年6月1日；23(11):1313-26.
doi:10.1101/gad.1781009。

microRNA miR-122在肝脏昼夜节律基因表达中的整合

大卫·加特菲尔德 1, Gwendal Le Martelot公司, 查尔斯·维纳, 丹尼尔·格拉赫, 奥利维尔·沙德, 法比安·弗勒里·奥莱拉, Anna Liisa Ruskeepää, 马特杰·奥雷西克, 克里斯汀·埃索, 叶夫根尼·M·兹多布诺夫, 尤利·席布勒
附属公司

microRNA miR-122在肝脏昼夜节律基因表达中的整合

大卫·加特菲尔德等。 基因开发. .

摘要

在肝脏中，大多数代谢途径都处于昼夜节律控制之下，因此数百个蛋白质编码基因以循环方式转录。在这里，我们发现节律性转录延伸到miR-122位点，这是一种高度丰富的肝细胞特异性microRNA。基因功能丧失和功能获得实验已确定孤儿核受体REV-ERAlpha是miR-122转录的主要昼夜节律调节器。尽管miR-122半衰期长，成熟期长，全天几乎以恒定的速度积累，但这种miRNA与控制昼夜基因表达的控制机制密切相关。因此，通过反义寡核苷酸（ASO）策略敲低miR-122表达导致数百个mRNA的上调和下调，其中不成比例的高比例以昼夜节律方式累积。miR-122以前与胆固醇和脂质代谢的调节有关。与这些途径相关的转录物确实在miR-122缺失时表现出最强的时间点特异性变化。Pparbeta/delta和过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARalpha）共激活物Smarcd1/Baf60a被鉴定为新的miR-122靶点，表明PPAR家族的昼夜代谢调节器参与miR-122介导的代谢控制。

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数字

图1。
图1。
miR-122前体是小鼠肝脏的昼夜节律。(A类)使用来自C57BL/6雄性小鼠的全细胞RNA对miR-122及其前体RNA进行Northern blot分析，这些小鼠24小时以指定的ZT值处死。每个时间点使用来自三只小鼠的RNA库，tRNA瑟和rpl19型mRNA在变性聚丙烯酰胺中作为负荷控制(顶部和中间的面板）和琼脂糖凝胶电泳(底部面板）。(顶部面板）miR-122和pre-miR-122。(中部面板）pre-mir-122和mir-122*。miR-122*是低水平并入RISC的反义“乘客链”。(底部面板）pri-mir-122。(B类,顶部和中间的面板）miR-122、miR-122*和前miR-122水平，归一化为tRNA瑟来自分析单个动物的Northern印迹（数据未显示）。平均值±SEM(底部面板）pri-mir-122水平的量化，归一化为昼夜不变量转速19，来自于A类.
图2。
图2。
REV-ERBα参与miR-122基因座的昼夜节律控制。(A类)六种哺乳动物pri-mir-122预测转录起始位点上游的基因组序列比对（摘自加州大学圣克鲁斯分校比对；参见补充图3）。显示了预测的RORE、TATA-box和转录起始位点。(B类)总RNA样品中pri-mir-122的Northern blot分析Rev-erbα敲除小鼠和同窝对照小鼠24小时按指定的ZT值处死。对于每个时间点，使用三只雌性小鼠的RNA池。(C类)Northern印迹的定量显示B类; 值被标准化为pri-mir-122rpl19型. (D类)通过Northern blot对来自所示基因型的单个动物（混合ZT）的总肝RNA中miR-122水平进行量化（数据未显示）。对照动物被设定为100%。数据为平均值±SEM(n个=36Rev-erbα−/−与。Rev-erbα+/+和n个=18（REV-ERBα过度表达vs.对照组）；(**)P（P）< 5*10−5（双尾学生的t吨-测试）。
图3。
图3。
分析ZT0和ZT12两个时间点的miR-122靶点。(A类)miR-122、let-7a和tRNA的Northern blot分析瑟用miR-122 ASO、miR-124 ASO或PBS处理的小鼠。每条车道装载三只小鼠的RNA池。(B类)Northern印迹的定量显示A类. (C类)如图所示，对用ASO或PBS处理的单个小鼠的RNA进行qPCR分析。使用的探针用于已知的miR-122目标糖原合成酶1和醛缩酶A，归一化为45S pre-rRNA。数值为平均值±SEM(n个= 3). (D类)相对于两个对照组，即124ASO和PBS处理的动物，在122ASO处理的动物中，探针的热图建立并下调（截止值1.5）。在底部of表示线性尺度上的变化，其中绿色和红色分别表示最小和最大表达。(E类)122ASO小鼠上调和下调组分中昼夜节律转录物的富集。P（P）-值由χ决定2测试。
图4。
图4。
昼夜节律基因是miR-122的靶点。(A类)昼夜节律探测器的热图(左边和中间的面板；取自Kornmann等人2007b），在122ASO小鼠中上调(正确的面板）。Smarcd1/Baf60a型仅低于Kornmann等人（2007b）微阵列数据中用于昼夜节律表达的严格标准，但也包括在图中，因为qPCR证实其为强健的昼夜节制（见图5）。在底部的面板表示线性范围内的变化，绿色和红色分别表示最小和最大表达。粗体形式的转录本在其3′UTR中包含潜在的miR-122种子位点。(B类)miR-122在3′UTR荧光素酶分析中的作用类似。控件只有载体3′UTR，不包含种子位点。3x凸起和Cat-1/hsSlc7a1是已知受miR-122调控的3′UTR的阳性对照。数值为平均值±SEM(n个≥6次转染）。（*）P（P）<10−2; (**)P（P）<10−3; (***)P（P）<10−4（双尾学生t吨-测试）。(C类)122ASO小鼠和PBS对照组前mRNA的qPCR分析(顶部面板）和mRNA(底部面板）所选成绩单的级别A类.历史1h1c是一个无内含子基因；因此，未测量前mRNA水平。请注意抄送1也在前mRNA水平上发生变化，因此可能受到间接转录效应的上调。数据是每种条件下三只小鼠的平均值±SEM。（*）P（P）<10−2（双尾学生的t吨-测试）。
图5。
图5。
122ASO和Rev-erbα昼夜不停地击倒老鼠。(A类)前mRNA(顶部面板）和mRNA(底部122ASO和PBS注射对照小鼠的指示转录物水平。对于每个数据点，使用从三到四只小鼠分离的总肝脏RNA池，通过qPCR测量三份转录水平。由于丰度低，前mRNA水平的检测不太可靠，qPCR分析中的误差条（标准偏差）通常较大。(B类)如中所示A类，前mRNA(顶部面板）和mRNA(底部面板）24小时测量的水平Rev erbα使用从五只雌性小鼠分离的全细胞肝脏RNA池，对基因敲除和野生型同窝动物进行研究。
图6。
图6。
miR-122和PPAR受体之间的交叉对话。(A类)如图4B所示，miR-122模拟物在3′UTR荧光素酶分析中的作用，使用Pparβ/δ和Smarcd1/Baf60a型3英尺UTR。数值为平均值±SEM(n个≥9次转染）。（***）P（P）<10−5（双尾学生的t吨-测试）。(B类)的表达式级别Pparβ/δ从Northern blots定量mRNA。数据为平均值±SEM(n个=每种情况下3只动物）。(C类)122ASO和PBS治疗小鼠PPARβ/δ蛋白的免疫沉淀-Western blot，如材料和方法所述。每个免疫沉淀都是从三只小鼠的提取物池中进行的。同一池中输入的U2AF65蛋白水平作为负荷控制。(D类)GC/MS测定的122ASO和PBS注射动物肝脏切片中的FFA水平。数值为平均值±SEM(n个= 6). （*）P（P）<0.05（双尾学生t吨-测试）。
图7。
图7。
miR-122如何影响其靶基因的昼夜节律表达的模型。(A类)即使是恒定的miR-122水平（深灰色）也可以通过不断抑制翻译的基础水平（由两个区域的重叠表示）来塑造目标（浅灰色）的昼夜节律。只有虚线区域所代表的靶mRNA的数量才能翻译成蛋白质。如漫画所示，这种机制可以增加循环的振幅，并将低振幅mRNA节奏转换为高振幅蛋白质节奏。此外，如讨论中所述，这种调节可以增强对低谷中低蛋白表达水平的耐受性。这幅漫画中描述的机制需要miRNA-靶相互作用的高亲和力和超过miRNA的靶点。考虑到miR-122可能有数百个靶点，其中许多靶点包含多个种子位点，即使对于这种高度丰富的miRNA，这种假设也相当合理(B类)可以想象，在散装miR-122的池中可能存在化学上不同的短寿命miR-122亚群（深灰色）。如果这些不同的miR-122物种也具有特定的功能特性，这个推测模型将意味着靶mRNA将受到昼夜节律的抑制。因此，可用于产生蛋白质的转录物（虚线区域）将显示昼夜节律振荡。(C类)可以想象，如讨论中所述，新组装的RISC复合物可以立即与它们的靶mRNA结合，并与它们保持稳定的关联。这种新组装的miR-122 RISC的可用性预计将紧随miR-122生产的昼夜节律（深灰色）。如果靶点也是昼夜转录的，则两个节律过程的相位关系将决定靶点在细胞中遇到miR-122 RISC的程度，以及这对所产生蛋白质（虚线区域）的昼夜振幅、幅度和相位的影响。如中所示A类，该模型将要求miRISC–mRNA的亲和力高，并且靶标过量。(D类)miR-122在昼夜肝脏基因表达中的整合模型。MiR-122被描述为昼夜节律输出基因的组织特异性调节剂，PPAR依赖的基因表达调控是受调控的输出途径之一。
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中的注释

  • 肝脏“滴答”。
    Shackel北美。 Shackel北美。 肝病学。2009年10月；50(4):1310-1. doi:10.1002/hep.23266。 肝病学。2009 PMID：19790199 没有可用的摘要。

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