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比较研究
.2009年6月;20(6):1293-302.
doi:10.1681/ASN.2008070759。 Epub 2009年5月21日。

多光子成像显示肾单位片段之间线粒体功能的差异

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比较研究

多光子成像显示肾单位片段之间线粒体功能的差异

安德鲁·M·霍尔等。 J Am Soc肾病. 2009年6月.

摘要

线粒体功能障碍可能在几种肾脏疾病的发病机制中发挥作用。尽管肾小管各段的功能作用和代谢需求不同,但对肾单位不同部位线粒体的特性知之甚少。临床上,近端小管似乎特别容易受到线粒体毒性的影响。在本研究中,我们使用活大鼠肾脏切片的多光子成像来研究肾单位线粒体功能的差异。远端小管的线粒体膜电位明显高于近端小管。呼吸抑制使近端小管的膜电位迅速下降,但远端小管的电位能更好地维持。抑制F1F(o)-ATP酶消除了这种差异,表明通过ATP酶活性维持远端小管的电位比近端小管更有效。免疫染色显示,近端小管中ATP酶与线粒体ATP酶内源性抑制剂IF1的表达比例低于远端小管。近端细胞的活性氧生成高于远端细胞,但NADPH氧化酶的抑制消除了这种差异。近端小管内谷胱甘肽水平较高。总的来说,近端小管中的线粒体比远端小管中线粒体处于氧化状态。总之,肾单位线粒体功能存在轴向差异,这可能与某些形式肾损伤的模式和病理生理学有关。

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图1。
图1。
(A至C)负载钙黄绿素的大鼠活体肾切片,在800 nm处激发,以证明其活性,并显示肾小球(A)、皮质髓质射线(B)和髓质(C)。(D) 除了形态不同外,当在800 nm激发时,通过绿色自荧光发射图案可以进一步区分PT和DT。在最初的实验中,使用肾固定切片中的抗体标记来确认肾单位切片的身份。(E) DTs中的反Tamm-Horsfall蛋白(红色)染色显示了切片制备中与PT(绿色自体荧光)在形态学上的明显差异。(F) 抗水通道蛋白1(绿色)染色用于确认PTs的身份。箭头,PT;箭头,DT。棒材=20μm。
图2。
图2。
(A) PT含有高密度线粒体,呈条纹状基底外侧分布。(B) DT中TMRM信号始终高于髓质射线中的近端直小管。(C) 近曲小管的信号大于近直小管,但仍不如DT高。(D) 信号模式与另一种Δψm依赖性染料罗丹明-123相同。箭头,PT;箭头,DT。棒材=20μm。(E) 描述了不同小管类型的平均±SE TMRM信号,包括寡霉素(5μg/ml)之前和之后30分钟。所示数据来自每个实验共三个切片中每个肾脏切片的三个随机选择的×40个目标场(**P(P)<0.001)。
图3。
图3。
(A和B)PTs和DTs中10μM维拉帕米均能增加TMRM的负荷(A),但西咪替丁(B)不能增加TMRM负荷。数据是每个实验共三片(维拉帕米)或四片(西咪替丁(*P(P)< 0.03).
图4。
图4。
(A) 负载TMRM的PTs在化学缺氧后Δψm迅速去极化。棒材=20μm。(B) 在DT中,缺氧60min后下降较慢,Δψm没有完全去极化;然而,在寡霉素(5μg/ml)存在下,当暴露于缺氧时,Δψm在远端管细胞中迅速去极化。数据是每个实验共15个PT、15个不含寡霉素的DT和29个含寡霉菌的DT的平均值±SE信号。数据从1(值为t吨=0,取静息Δψm)至0(FCCP后的最小值,取0 mV)。
图5。
图5。
IF1(红色,A)和线粒体ATP酶的ATP5b亚单位(绿色,B)的免疫染色。ATP合酶图像与IF1图像的比率(颜色编码如0和2之间的值所示)(C)表明,远端小管中ATP5b与IF1的比率显著高于近端小管(D)。结果显示了15个近端小管和18个远端小管的平均比率(**P(P)< 0.001). 箭头,PT;箭头,DT。棒材=20μm。
图6。
图6。
(A) 由于ROS的产生,HEt负荷肾切片细胞核中的荧光信号随时间增加,PTs中ROS生成的基本速率高于DTs。20分钟后,向灌流液中添加10μM鱼藤酮。这导致PT中ROS生成速率的增加相对大于DT。数据是来自四个单独切片的总共54个PT和26个DT细胞的每个细胞核的平均值±SE荧光信号(以起始信号的百分比表示)。(B) 在500μM罗布青素(NADPH氧化酶抑制剂)存在下重复实验。正如预期的那样,ROS生成速率较低,因此使用了不同的显微镜设置。在这些条件下,发现两种小管类型的ROS生成的基本速率相似,但再次观察到鱼藤酮对PT中ROS生成速率的影响相对较大;给出的平均值来自三个单独切片的37个PT和31个DT细胞。(C) 图中描绘了鱼藤酮后10分钟HEt信号的代表性图像(在无罗布青素的情况下)。(D) 根据荧光指示剂一氯二烷的测定,PTs中抗氧化剂GSH的水平高于DTs。50分钟后达到稳定状态。数据是来自四个单独切片的总共40个PT和26个DT的每个小管的平均值±SE信号。(E) 描绘了50分钟后的代表性图像。箭头,PT;箭头,DT。棒材=20μm。
图7。
图7。
(A) 线粒体NADH在720 nm处被激发。(B和C)对RC阻滞剂氰化物(B)的反应增加,对RC解偶联剂FCCP(C)的反应减少,证实了信号的一致性。(D到F)FAD2+在458nm(D)处激发,并观察到NADH对氰化物(E)和FCCP(F)的相互变化。箭头,PT;箭头,DT。巴=20μm。(G和H)NADH和FAD的校准2+氰化物(最大还原状态)和FCCP(最大氧化状态)的信号显示,在静息状态下,PT中的线粒体比DT中的线粒体更氧化。数据是NADH五个单独切片中总计38个PT和29个DT的平均值±SE,FAD四个单独切片的43个PT和42个DT2+(**P(P)<0.001)。

中的注释

  • 利用多光子技术阐明线粒体功能和功能障碍。
    Weinberg JM,Molitoris文学学士。 Weinberg JM等人。 《美国肾脏病杂志》。2009年6月;20(6):1164-6. doi:10.1681/ASN.2009040419。Epub 2009年5月21日。 《美国肾脏病杂志》。2009 PMID:19470668 没有可用的摘要。

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