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.2009年5月13日；29(19):6276-84.
doi:10.1523/JNEUROSCI.4304-08.2009。

线粒体基质中烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶的表达延缓Wallerian变性

直木雅哈塔 1, Yuasa志贵, 荒木俊彦
附属公司

线粒体基质中烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶的表达延缓Wallerian变性

直木雅哈塔等。 神经科学. .

摘要

对自然发生的突变小鼠（wld（s））进行的研究表明，轴突退行性变是一个活跃的过程。我们之前的研究表明，通过过度表达烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶（NMNAT）增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）合成活性是Wld（s）蛋白的基本成分，其表达与Wld（s）小鼠的延迟Wallerian变性表型有关。事实上，NMNAT在培养神经元中的过度表达也为神经突提供了强有力的保护。为了检测体内NMNAT过表达的影响并分析引起轴突保护的机制，我们产生了过表达NMNAT1（核同种型）、NMNAT3（线粒体同种型）或携带W258A突变的Wld（s）蛋白的转基因小鼠（Tg），W258A突变破坏了Wld（s）蛋白的NAD合成活性。NMNAT3-Tg的Wallerian变性延迟与wld（s）小鼠相似，而NMNAT1-Tg或wld（s）（W258A）-Tg的轴突保护未检测到。对过表达蛋白亚细胞定位的详细分析表明，轴突保护表型与NMNAT酶活性在线粒体基质中的定位相关，我们发现，显示轴突保护的小鼠分离的线粒体表达的呼吸链成分水平没有变化，但能够增加ATP的生成。这些结果表明，神经元中NMNAT表达的轴突保护作用是通过改变线粒体功能实现的。线粒体功能的改变可能是一种新的轴突保护工具，也可能是治疗涉及轴突疾病的一种方法。

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数字

图1。
图1。
过度表达NMNAT1、NMNAT3和Wld的转基因小鼠的产生秒（W258A）。使用含有CAG启动子的载体生成三个转基因小鼠系。施工示意图见A类转基因衍生蛋白质被设计成用六组氨酸标记。免疫印迹分析证实其表达(B类)或通过大脑皮层切片的免疫组织化学(C类)用抗体对抗他的标签。α-管蛋白在B类注意，包括神经元在内的大多数细胞都表达所有构建物的转基因衍生蛋白。比例尺，50μm。D类，在NMNAT1-Tg、NMNAT3-Tg、Wld中观察到NAD合成活性的差异表达秒（W258A）-Tg，和世界级秒老鼠。通过转基因小鼠大脑裂解物中NAD合成速率评估NMNAT酶活性。一个活性单位被定义为每小时催化合成1 mmol NAD的蛋白质量。误差条指示SD。
图2。
图2。
NMNAT3-Tg小鼠表现出与世界级秒老鼠。在坐骨神经损伤模型中检测轴突变性。在NMNAT3-Tg（第819行和第822行）中检测了横断坐骨神经远端的神经丝免疫反应，世界级秒小鼠，以及神经损伤后14d的野生型对照组，并通过免疫印迹分析与未损伤对照组进行比较(A类)伤后14d纵向切片免疫组化观察(B类). α-管蛋白在A类注意，即使在损伤后14天，神经丝表达仍保持接近野生型水平。比例尺，50μm。C类，在损伤部位远端2mm处横断7d后，在甲苯胺蓝染色的半薄切片（1μm厚）上分析指定小鼠的损伤神经形态。NMNAT3-Tg和世界级秒小鼠的髓鞘结构明显完整，几乎与未受损的对照组相当，而野生型小鼠的受损神经缺乏完整的髓鞘，表现出严重的退化。比例尺，20μm。D类，损伤后第7天位于横断部位远端2 mm处受损坐骨神经横截面的电镜图像。在NMNAT3-Tg和世界末日秒而野生型小鼠受损神经中观察到有髓和无髓（星号）轴突的严重变性和髓鞘结构的破坏。比例尺，2μm。E类，计算受损坐骨神经横切面（横断后7天）中NMNAT3-Tg（第822行）形态学保留的轴突数量，世界级秒和野生型小鼠(n个=每个基因型为7），并显示为占轴突总数的百分比。误差条指示SD。
图3。
图3。
Wallerian变性通常发生在NMNAT1-Tg或Wld秒（W258A）-Tg。在坐骨神经损伤模型中检测轴突变性。在NMNAT1-Tg（744和748行）中检测了横断坐骨神经远端的神经丝免疫反应，世界级秒小鼠，世界级秒（W258A）-Tg（品系1032和1037），以及野生型对照，在神经损伤后3和4天，通过免疫印迹分析与未损伤对照进行比较(A类)和纵向切片上的免疫组织化学(B类). α-管蛋白在A类.比例尺，50μm。注意，NMNAT1-Tg或Wld中甚至没有观察到轴突的细微保护秒（W258A）-Tg。
图4。
图4。
线粒体定位在NMNAT3和Wld之间共享秒蛋白质。转基因衍生蛋白在NMNAT1-Tg、NMNAT3-Tg和Wld中的亚细胞定位秒蛋白质世界级秒如图所示，通过顺序离心法测定小鼠A类.B类NMNAT1和NMNAT3主要在每个转基因小鼠的P1（细胞核）和P2（线粒体）中检测到。世界银行秒蛋白质世界级秒小鼠分布广泛，包括线粒体。
图5。
图5。
NMNAT3和Wld秒蛋白质位于线粒体基质中。线粒体从NMNAT3-Tg或世界级秒对小鼠进行亚分馏以获得外膜（OM）、膜间隙（IMS）、内膜（IM）和基质（Mx）的组分。通过免疫印迹分析确认每个组分的分离，以检测VDAC（OM）、细胞色素c（c）（IMS）、COX IV（IM）和MnSOD（Mx）。NMNAT3或Wld秒分别用抗His标签和抗Wld18抗体检测IM和Mx组分中的蛋白质。世界秒蛋白质特异性带用箭头表示。
图6。
图6。
NMNAT的线粒体表达增加了ATP合成能力，而不影响电子转移链酶的表达。在NMNAT3-Tg的大脑粗裂解液中检测了复合物II 70 kDa Fp和复合物III核心2蛋白的表达，世界级秒以及野生型小鼠(A类). 神经丝作为负荷控制。在线粒体颗粒中检测了电子转移复合物的代表性成分（复合物I亚单位GRIM-19、复合物II亚单位70 kDa Fp、复合物III亚单位核心2、COX IV和复合物V亚单位β）的表达（补充图S2A类，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）（P2分数），从NMNAT3-Tg（第822行）获得，世界末日秒免疫印迹分析法检测小鼠和野生型小鼠(B类). 使用从NMNAT3-Tg（品系822）、，世界级秒小鼠和野生型小鼠。计算ATP合成活性（每分钟每微克蛋白质的ATP纳米数）；每种情况下所示动物数量的平均值±SD(*第页< 0.05; **第页<0.01，单因素方差分析，然后进行Tukey检验）(C类).
图7。
图7。
过度表达的NMNAT1、NMNAT3和Wld的亚细胞定位示意图秒神经元中的蛋白质。虽然NMNAT1是一种核蛋白(A类)，当高表达时，它也可能位于细胞核外，靠近线粒体(B类). 世界秒蛋白质也位于细胞核外，可能是因为N末端70个氨基酸的序列(C类). NMNAT1或Wld秒接近线粒体的蛋白质可以被转运到线粒体基质中，导致表型与观察到的表型不可分割D类.
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