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.2009年8月;17(8):1387-94.
doi:10.1038/mt.2009.90。 Epub 2009年5月12日。

热休克蛋白27作为头颈部鳞癌放射增敏的新靶点

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热休克蛋白27作为头颈部鳞癌放射增敏的新靶点

埃利·哈奇蒂等。 分子治疗. 2009年8月.

摘要

在许多人类癌症中,热休克蛋白27(Hsp27)水平的升高与肿瘤的发生、转移、抗癌治疗的耐药性以及预后不良密切相关。在本研究中,我们评估了使用第二代反义寡核苷酸OGX-427(ASO)沉默Hsp27基因对放射抗性头颈鳞癌(HNSCC)SQ20B细胞的放射增敏作用。在体外,Hsp27的下调显著增强辐射诱导的凋亡和克隆形成死亡,并促进Akt失活。在体内,OGX-427与局部肿瘤照射(5 x 2 Gy)相结合导致SQ20B肿瘤显著退化,这与高凋亡率和谷胱甘肽抗氧化防御水平降低有关。增加总辐射剂量(15 x 2 Gy)显著放大OGX-427的放射增敏作用。OGX-427联合放射治疗肿瘤导致血管生成减少,与Akt通路激活减少相关。此外,联合治疗提高了SQ20B荷瘤小鼠的存活率,并且没有出现急性和延迟毒性的迹象。我们的研究结果首次表明,Hsp27敲除增强了体内放疗的细胞毒性作用,并为使用Hsp27反义技术治疗HNSCC放射抗性癌症患者的临床试验提供了临床前原则证明。

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<b>图1</b>
图1
OGX-427敲低Hsp27可使SQ20B细胞对辐射敏感。()免疫印迹分析SQ20B-MS对照细胞和SQ20B–OGX-427细胞对0或10 Gy照射的反应。(b)免疫印迹分析Hsp27、Hsp70和Hsp90蛋白表达对0或10Gy照射的反应。在凝胶上装载蛋白质(10µg)。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),作为负荷控制。(c(c))SQ20B-MS对照细胞系和SQ20B–OGX-427细胞系在0至8 Gy剂量范围内照射后的细胞存活率。照射后6次细胞分裂后,对大于64个细胞的集落进行评分。(d日)通过流式细胞术定量总半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性。每个值代表一式三份的两个实验的平均值±SD**P(P)< 0.005, ***P(P)与辐照的SQ20B MS对照细胞相比,<0.001。未辐照对照组表示在基础条件下获得的每个转染细胞系的平均结果(一式三份)。(e(电子))照射48小时后进行荧光DAPI染色。凋亡细胞在细胞核中出现典型的分裂染色质(白色箭头)(原始放大倍数×40)。((f))SQ20B-MS对照细胞和SQ20B–OGX-427细胞经0或10 Gy照射后,Akt磷酸化活性形式(pAkt)的免疫印迹分析。DAPI,4′-6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐;GAPDH,甘油醛-3-磷酸脱氢酶;热休克蛋白。
<b>图2</b>
图2
OGX-427联合放疗可增强SQ20B异种移植瘤的消退。随机选择患有SQ20B肿瘤的小鼠进行PBS治疗,连续5天(第1周)每天注射10 mg/kg MS-对照或OGX-427,然后每周注射3次,持续5周,与局部肿瘤照射相关或不相关,总剂量为10或30 Gy,每日剂量为2 Gy()与10Gy辐射相关或不相关的PBS、MS-control或OGX-427寡核苷酸治疗后的肿瘤演变(第2周,实验一)。(b)PBS治疗后的肿瘤演变与30Gy照射相关或无关,OGX-427加上30Gy(第2、3和4周,实验II)。每周测量一次肿瘤体积,结果表示为相对于治疗开始时测量的平均值±SD。(c(c))治疗结束时代表每组小鼠的肿瘤标本照片(实验二)。(d日)在所有实验组(每组两个不同的肿瘤)治疗结束时,对SQ20B异种移植瘤中的Hsp27、Hsp70和Hsp90蛋白进行免疫印迹分析。将蛋白质(2µg)加载到凝胶上。GAPDH,甘油醛-3-磷酸脱氢酶;热休克蛋白;PBS,磷酸盐缓冲盐水。
<b>图3</b>
图3
联合治疗可提高小鼠的存活率,且无明显毒性。()Kaplan–Meyer存活曲线表示实验II各组在指定时间点的存活小鼠百分比。(b)用PBS、MS-control或OGX-427寡核苷酸治疗后与10Gy照射相关或不相关的小鼠体重监测(实验一)。(c(c))PBS治疗后的体重监测是否与30Gy照射和OGX-427+30Gy照射相关(实验二)。每周测量一次体重,结果表示为相对于治疗开始时测量的体重的平均值±SD。(d日)苏木精、地黄和藏红花染色后,在石蜡包埋组织切片上评估肿瘤周围肝、肺、脑和肌肉的组织形态学(第6周,实验II)。放大倍数×100。PBS、磷酸盐缓冲盐水。
<b>图4</b>
图4
OGX-427敲低Hsp27并结合辐射可诱导细胞凋亡,降低肿瘤内谷胱甘肽水平和血管生成,但不会改变细胞增殖。()在石蜡包埋的肿瘤切片上使用TUNEL和活性半胱氨酸蛋白酶-3染色检测细胞凋亡(×400或×100放大倍数)。(b)在两个实验的治疗结束时收集的肿瘤,通过HPLC测定总谷胱甘肽水平。每个值代表每个收集肿瘤的三份样品的平均值±SD*P(P)<0.05与30Gy照射肿瘤相比。(c(c))分别使用Ki-67和CD31免疫染色检测两个实验治疗结束时采集的肿瘤的肿瘤细胞增殖和血管生成(放大×100或×200)。增殖指数计算为每个肿瘤在×400放大倍数下在20个随机场中计数的Ki-67阳性细胞的百分比。微血管密度(MVD)通过计算每个肿瘤在放大×200倍的10个随机场中的微血管数量来量化*P(P)<0.05与30Gy照射肿瘤相比。(d日)治疗结束时SQ20B异种移植瘤中磷酸化Akt活性形式(pAkt)的免疫印迹分析(每组两个不同的肿瘤)。将蛋白质(10µg)加载到凝胶上。GAPDH,甘油醛-3-磷酸脱氢酶;高效液相色谱法;热休克蛋白;PBS,磷酸盐缓冲盐水;TUNEL,末端核苷酸转移酶介导的缺口末端标记。

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