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.2009年5月；130(5):297-307.
doi:10.1016/j.mad.2009.01.004。 Epub 2009年1月29日。

生物能量学和心脏肌下膜和纤维间线粒体的通透性转换孔开放：衰老和终身热量限制的影响

蒂姆·霍弗 1, 斯蒂芬·塞瓦斯（Stephane Servais）, 阿诺德·杨修, 伊曼纽尔·马泽蒂, 阿西米娜·希奥纳, Shashank Jagdish Upadhyay公司, 斯蒂芬妮·伊娃·沃尔格穆思, 克里斯蒂安·吕文伯格
附属公司

生物能量学和心脏肌下膜和纤维间线粒体的通透性转换孔开放：衰老和终身热量限制的影响

蒂姆·霍弗等。 机械老化开发. 2009年5月.

摘要

随着年龄增长，心肌线粒体功能的丧失可能通过线粒体介导的凋亡因子释放而导致心肌细胞死亡增加。我们研究了心室肌下膜（SSM）和纤维间膜（IFM）线粒体生物能量学，以及随着年龄增长和终身热量限制（CR）对Ca（2+）诱导的通透性转换孔（mPTP）开放的敏感性。从8个月、18个月、29个月和37个月龄的雄性Fischer 344 x Brown Norway大鼠中分离出心肌线粒体，这些大鼠可以随意进食（AL）或摄入40%的限制热量饮食。随着年龄的增长，SSM和IFM的H（2）O（2）生成没有增加，耗氧量也没有显著降低。值得注意的是，IFM在衰老过程中对mPTP开放的敏感性增加。相反，SSM的Ca（2+）保留能力不受年龄的影响，但SSM比IFM耐受的Ca，腺嘌呤核苷酸转位酶（ANT）和电压依赖性离子通道（VDAC）不受老化或CR的影响。总之，IFM中Ca（2+）保留能力的年龄相关性降低可能解释了衰老心肌对应激诱导细胞死亡的敏感性增加。

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数字

图1
图1
钙2+心室线粒体的滞留能力。脉冲钙2+使用谷氨酸/苹果酸（上图）或琥珀酸（中图）作为呼吸底物监测线粒体摄取，直到mPTP开放。条形图显示Ca含量2+可以在mPTP打开之前添加脉冲。钙显著下降2+随着年龄的增长，特别是在IFM（左侧）对谷氨酸盐/苹果酸盐的衰老过程中，观察到了保留能力(第页<0.001）（a）或琥珀酸(第页<0.01）（c），采用双向方差分析。SSM（右侧）对两种底物（b，d）均无年龄效应(第页<0.001-0.05，双向重复测量ANOVA）较低Ca2+所有组的保留容量均大于IFM（未注明）。与谷氨酸/苹果酸相比，在这两个亚群体中，使用更大的活性氧生成物琥珀酸增加了mPTP开放的脆弱性。SSM维持在0.75 mg/ml，IFM维持在0.1 mg/ml（谷氨酸/苹果酸）或0.4 mg/ml（琥珀酸）。与PTP抑制剂CsA共注入阻止了mPTP的开放。采用单向方差分析和Tukey的事后检验进行补充分析，得出共享相同字母的酒吧之间存在显著差异(a、 b条第页< 0.001,c、 d日第页< 0.01,电子第页<0.05）。相同年龄的AL组和CR组之间无统计学差异。数据显示为平均值±SEM nmol Ca2+每毫克线粒体蛋白的摄取，直到mPTP开放，触发钙爆发2+释放。下图显示了超心智钙的示例2+使用荧光探针监测8和37个月龄AL喂养大鼠（以谷氨酸/苹果酸为底物）的（e）IFM（0.1 mg/ml）和（f）SSM（0.75 mg/ml）中的钙绿-5N。1.25 nmol钙2+每分钟都会添加。箭头(↓) 当Ca2+理解开始变得困难。mPTP抑制剂环孢霉素A（CsA）阻止Ca2+-诱导爆发。缩写：a.u.=任意单位。
图2
图2
用H测定心脏线粒体中的ROS生成2O（运行）2H的相似比率2O（运行）2观察IFM（左侧）和SSM（右侧）（a，b）谷氨酸/苹果酸、（c，d）琥珀酸和（e，f）琥珀酸酯+鱼藤酮的生成。琥珀酸的产量高于谷氨酸/苹果酸，鱼藤酮的添加使其含量降至谷氨酸/果酸水平。对于SSM，速度略有增加(第页<0.05），而谷氨酸/苹果酸（b）的CR率略有下降(第页<0.05）。此外，双向方差分析也检测到琥珀酸（d）的CR略有下降(第页<0.05），对于IFM，琥珀酸与年龄（c）有关。通过Tukey的多重比较测试，每个线粒体亚组内所有组的显著差异共享相同的字母(a、 b条第页<0.05），并且通过双向重复测量，相同年龄和饮食的SSM组和IFM组之间的显著差异ANOVA具有相同的希腊字母(α第页< 0.05). 数据表示为平均值±SEM nmol H2O（运行）2/min和mg线粒体蛋白。
图3
图3
O（运行）2心脏线粒体的消耗。对于（a，b）状态II（谷氨酸/苹果酸）、（c，d）状态III（谷氨酸盐/苹果酸+ADP）和（g，h）解偶联状态（谷氨酸钠/苹果酸盐+FCCP），IFM（左侧）的呼吸频率通常高于SSM（右侧），而对于（i，j）RCR（=状态III/状态II），其呼吸频率相似。SSM显示状态III的CR率下降(第页<0.001），且在解耦时(第页<0.01）以及略微增加的比率(第页<0.05）。通过添加外源细胞色素测试线粒体外膜完整性（e，f）c（c）在状态III（谷氨酸/苹果酸+ADP）下，呼吸活动变化不大。通过Tukey的多重比较测试，每个线粒体亚组内所有组的显著差异共享相同的字母(a、 c（c）第页< 0.05,b、 d日第页<0.01），通过双向重复测量，SSM组和IFM组在相同年龄和饮食之间的显著差异方差分析共享相同的希腊字母编号(α第页< 0.05,β第页< 0.01,γ第页<0.001）。数据（RCR除外）表示为平均值±SEM nmol O2/min和mg线粒体蛋白。缩写：RCR，呼吸控制率（状态III/状态II）。
图4
图4
心脏细胞色素c（c）caspase-9和-3活性。（a） 细胞溶胶细胞色素c（c）随年龄增长水平显著增加(第页<0.01）高达29个月。浓度表示为每种浓度的细胞溶质蛋白。（b） 胞浆caspase-9活性随年龄增长而增加，但影响不显著(第页= 0.18). （c） 胞浆caspase-3活性随年龄增长显著增加(第页< 0.01). 共享同一字母的酒吧(一第页<0.01）与Tukey’s有显著性差异。
图5
图5
通过蛋白质印迹检测心脏线粒体蛋白水平。（a）IFM和（b）SSM的COX4凝胶带强度与在所有凝胶中平行运行的相同交叉样品（设置为1）的凝胶带强度相关，或直接通过相同样品的COX4COX4表达（c，d）ANT、（e，f）VDAC、（g，h）CyP-d（21 kDa）和（I，j）LCyP-d。通过双向重复测量，相同年龄和饮食的SSM（左）和IFM（右）组之间的显著差异ANOVA共享相同的希腊字母(α第页< 0.05,β第页< 0.01). 对每个线粒体亚组中的所有组进行的双向ANOVA和Tukey多重比较测试没有给出显著结果。数据表示为平均值±SEM。
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