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比较研究
.2009年4月22日；29(16):5051-61.
doi:10.1523/JNEUROSCI.0324-09.2009。

Rett综合征星形胶质细胞异常并通过缝隙连接传播MeCP2缺乏

前泽一美 1, 苏珊·斯旺伯格, 丹妮尔·哈维, 珍妮·拉萨尔, 李维珍
附属公司
比较研究

Rett综合征星形胶质细胞异常并通过缝隙连接传播MeCP2缺乏

前泽一美等。 神经科学. .

摘要

MECP2是一种编码表观遗传因子甲基CpG结合蛋白-2的X连锁基因，在雷特综合征（RTT）中发生突变，在自闭症中异常表达。大多数受RTT影响的儿童是杂合子Mecp2-/+女性，出生后由于Mecp2缺乏导致脑功能受损。虽然之前对MeCP2的功能性研究只关注神经元，并得出结论：星形胶质细胞中不存在MeCP2，但在此我们报告星形胶质细胞表达MeCP2并且星形胶质细胞缺乏MeCP2会导致BDNF调节、细胞因子产生和神经元树突状诱导的显著异常，可能导致神经发育异常的影响。此外，我们发现，MeCP2缺乏状态可以通过镶嵌型MeCP2-/+星形胶质细胞之间的缝隙连接通信在一种新的非细胞自主机制中至少部分地进行传播。这种机制可能导致选择性地在小鼠MeCP2-/+脑星形胶质细胞中观察到MeCP2的显著丢失，这与RTT的表型回归特征一致。我们的结果表明，星形胶质细胞是RTT的可行治疗靶点，也可能是退化型孤独症的治疗靶点。

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数字

图1。
图1。
星形胶质细胞表达MeCP2。A类对所示小鼠的海马切片进行MeCP2（红色核染色）和星形细胞标记物GFAP（绿色细胞质染色）的联合免疫染色。相应CA1区域的显微照片显示在上排，而来自辐射层的放大场显示在下排。箭头指向MeCP2+星形胶质细胞示例，虚线方框括起明显为MeCP2−星形胶质细胞的示例。B、Wt水平和突变机械2小鼠星形胶质细胞表达的转录物机械2用定量RT-PCR检测基因型。所示为凝胶中的PCR产物。PCR产物不是从基因组DNA中扩增出来的，因为没有逆转录酶（−RT控制）的PCR产物很少。C类，Western blot分析来自小鼠星形胶质细胞的细胞裂解物机械2基因型，通过两种不同的抗体进行分析。D类Western blot分析初级神经元和初级星形胶质细胞的裂解物，以比较它们的MeCP2蛋白水平。中的MeCP2频带机械2 −/+由于ECL发育有限，无法充分比较Wt神经元和Wt星形胶质细胞，因此几乎无法检测到星形胶质细胞样本。E类，来自小鼠的星形胶质细胞机械2基因型培养和免疫染色A类并用DAPI（蓝色）复染。箭头指向MeCP2+星形胶质细胞示例，箭头指向MeCP−星形胶质细胞的示例。
图2。
图2。
MeCP2缺乏的星形胶质细胞在调节Bdnf公司、细胞因子和p38MAPK。A类,Bdnf公司通过定量RT-PCR测量mRNA水平，并将其标准化为β-肌动蛋白图中所示为凝胶中的PCR产物。BWestern blots分析星形胶质细胞条件培养基（ACM）释放的BDNF、神经生长因子（NGF）和载脂蛋白E（ApoE）。C类用酶联免疫吸附法（ELISA）测定LPS处理的ACM中指示的细胞因子。n个= 3, *第页<0.05和**第页与Wt相比，<0.001。在没有LPS刺激的情况下，所有三种细胞因子的基础水平都很低，并且各组之间没有显著差异。D类通过Western blot检测p38MAPK、ERK和JNK在未刺激星形胶质细胞中的激活状态，并使用其各自磷酸化表位的抗体进行评估。使用p38MAPK抗体量化总p38MAPK水平。p38MAPK的激活由磷酸化p38MAPK的带强度表示，磷酸化p38 MAPK的带强度归一化为总p38MAPK。条形图显示p38MAPK激活在机械2 −/+和机械2 −/年星形胶质细胞与Wt-As的比较。n个= 3, *第页与重量相比<0.05。E类，24小时LPS刺激后星形胶质细胞中p38MAPK的激活。如中所示D类，没有刺激机械2 −/年和机械2 −/+星形胶质细胞p38MAPK磷酸化增加约1.5倍。LPS刺激后，各组间磷酸化水平无差异。
图3。
图3。
MeCP2缺乏的星形胶质细胞支持Wt神经元的树突状生长较少。将E18 Wt海马神经元放在不含星形胶质细胞的培养皿上或放在指定基因型的星形胶质细胞汇合单层上。允许树突生长24和72小时。A类，72小时共培养的代表性相控图像。B树突状标记物MAP2（红色）的免疫染色显示树突状。所示为72小时共培养的代表性显微照片。C类每个培养条件下每个神经元的树突总长度通过Neuroucida和Neuroexplorer软件进行量化。对四个独立实验中单个神经元数量（条形图所示）的树突进行成像和分析。四组之间的平均树突长度存在显著差异(第页< 0.001). 在事后（post-hoc）经多次比较校正后的两两比较，Wt-As诱导的平均树突状长度显著高于其他各组（*），但在具有机械2 −/+和机械2 −/年.D类，将24小时树突长度数据进一步分层为每个分支顺序的平均长度。E类，通过计算每个订单的分支点数量来评估分支点复杂性。机械2 −/+和机械2 −/年星形胶质细胞诱导的树突长度和分支点数量小于Wt-As，分支顺序为1-4(第页<0.02），但在机械2 −/+和机械2 −/年(第页=0.1，对于树枝长度和第页=0.86（对于支点编号）。F类，通过计数NeuN-免疫反应阳性细胞核获得神经元数量，并根据每个实验中“仅神经元”组的神经元数量进行归一化。
图4。
图4。
非细胞自主效应降低了Wt-As的MeCP2表达机械2 −/+文化。A类Western blot分析培养的星形胶质细胞在指定时间内的MeCP2水平在体外.B，GFP标记的Wt-As（绿色）与未标记的Wt-As或机械2 −/+星形胶质细胞，随后用抗MeCP2（红色）和DAPI（蓝色）染色。左侧面板中的箭头指向GFP-标记的Wt-As，它在MeCP2+星形胶质细胞附近保持了高水平的MeCP2表达。右侧面板中的箭头指向一个GFP标记的Wt-As，它在MeCP2−星形胶质细胞附近失去了MeCP2表达。C类GFP标记的Wt-As中MeCP2免疫反应分为三级：高、低和无。所示为这三层MeCP2表达中细胞的平均百分比。在四个独立实验中，每组共分析约350个GFP标记细胞。在各组之间观察到高表达与低表达分布的变化（见材料和方法）(第页< 0.01).D类GFP-标记的Wt-As与机械2 −/+星形胶质细胞。n个= 3.
图5。
图5。
机械2 −/+处于立即症状前或早期症状阶段的小鼠显示星形胶质细胞MeCP2显著减少。对来自指定小鼠的海马切片进行MeCP2（红色核染色）/NeuN（绿色核染色）的共免疫染色(A类)或MeCP2/GFAP（绿色细胞质染色）(B). 在A类，箭头指向辐射层中MeCP2+非神经元细胞的例子，这些细胞很容易在7个月大的婴儿中发现机械2 +/+小鼠（两个左侧面板），但在7个月大的小鼠中很少发现机械2 −/+鼠标（两个右面板）。在B，箭头指向MeCP2+星形胶质细胞示例，虚线方框括起明显为MeCP2−星形胶质细胞的示例。7个月大的大多数星形胶质细胞机械2 −/+小鼠似乎是MeCP2−。
图6。
图6。
MeCP2−和MeCP2+星形胶质细胞之间的非细胞自主效应至少部分由GJ介导。GFP-标记的Wt-As与未标记的Wt-As共培养，机械2 −/+星形胶质细胞（−/+A），以及机械2 −/+分别用GJ抑制剂CBX和GA培养星形胶质细胞24小时。在另外两组中，抑制剂对GJ的抑制被甲苯磺丁脲（TB）特异性阻止。在另外两组中Cx-43号-分别使用特异性siRNA实现GJ抑制和对照siRNA。对每种培养物中GFP标记的Wt-As中的MeCP2免疫反应进行分析，并如图4所示C类MeCP2高表达（因此低表达）细胞的平均百分比在各组之间存在差异(第页< 0.01).后hoc经多重比较调整后的两两比较表明，在以下方面，从高表达到低表达有显著转变：（1）从“w/Wt-a”到“w/−/+a+CBX+TB”，再到“w/−/+a+GA+TB”；（2） 从“w/−/+A+GA”到“w/‐/+A”，再到“w/−/+A+GA+TB”；（3） 从“w/−/+A+CBX”到“w/‐/+A”，再到“w/−/+A+CBX+TB”；（4） 从“w/Wt-A”到“w/−/+A+控制siRNA”；和（5）来自“w/−/+A+连接43siRNA“到”w/−/+A+控制siRNA“
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