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.2009年3月4日；101(5):350-9.
doi:10.1093/jnci/djn509。 Epub 2009年2月24日。

肿瘤干细胞的体内成像、跟踪和靶向

埃里娜·弗拉西 1, 金光熙, Chann Lagadec公司, 洛伦扎·德拉·唐纳, 约翰·泰森·麦克唐纳, Mansoureh Eghbali公司, 詹姆斯·塞尔, 恩克里科·斯特凡尼, 威廉·迈克布莱德, 弗兰克·帕容克
附属公司

肿瘤干细胞的体内成像、跟踪和靶向

埃里娜·弗拉西等。 美国国家癌症研究所. .

中的勘误表

  • 美国国家癌症研究所杂志，2009年6月3日；101(11):833

摘要

背景：越来越多的证据表明，实体癌含有致癌细胞（CIC），这些细胞能够再生手术切除和/或化疗和/或放射治疗后的肿瘤。目前，细胞表面标记物，如CD133或CD44，用于体外识别CIC；然而，这些标记物不能用于体内识别和追踪CIC。26S蛋白酶体是增殖细胞内许多过程的主要调节器，其活性可能根据细胞的表型而改变。

方法：对人脑胶质瘤和乳腺癌细胞进行工程设计，使其稳定表达与鸟氨酸脱羧酶羧基末端脱基融合的ZsGreen，从而产生荧光融合蛋白，在缺乏26S蛋白酶体活性的细胞中积聚；通过检测荧光肽底物的裂解，在平板阅读器中监测单个蛋白酶的活性。通过定量逆转录聚合酶链反应评估表达融合蛋白的细胞中蛋白酶体亚基的表达，并通过球体形成分析、体外已知干细胞标志物的免疫组织化学染色和体内分析其致瘤性来评估CICs的干细胞表型。在对荷瘤小鼠进行放射治疗后，通过体内荧光成像追踪CIC，并通过胸腺嘧啶核苷激酶-egron融合构建物进行特异性靶向。所有P值均来自双侧试验。

结果：在富含癌干细胞（CSC）的条件下，作为球形培养物生长的癌细胞相对于各自单层的蛋白酶体活性降低（球形培养物相对于单层的类糜烂活性降低百分比——U87MG:26.64%，95%置信区间[CI]=10.19至43.10，GL261，52.91%，95%CI=28.38至77.43）。因此，可以通过荧光蛋白（ZsGreen）的积累来监测体内外蛋白酶体活性较低的癌细胞，该荧光蛋白融合到一个靶向26S蛋白酶体降解的去离子上。在体外，与ZsGreen阴性细胞相比，ZsGreen-阳性细胞具有更强的成球能力，表达CSC标记，并且缺乏分化标记。在体内，将ZsGreen阳性细胞注射到裸鼠体内时，其致瘤性大约是ZsGreen-negated细胞的100倍（ZsGreene阳性，每组30只；ZsGrene阴性，每组31只），并且在放射治疗72小时后，肿瘤中的CIC数量增加。CICs通过蛋白酶体依赖性自杀基因被选择性靶向，其在体内的消除导致肿瘤消退。

结论：我们的结果表明，26S蛋白酶体活性降低是CICs的一个普遍特征，可以很容易地在体内外识别、跟踪和靶向CICs。

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数字

图1
图1
基于蛋白酶体活性的致癌细胞特征。A、 B类)U87MG单层培养物（A）和U87MG-衍生初级球体（B）中细胞的频率，ZsGreen-cODC积累，因此蛋白酶体活性低。C、 D类)U87MG（C）和GL261（D）单层和球形培养物中26S蛋白酶体的蛋白酶体活性。表示从三到四个独立实验（每个实验四个重复）得出的±95%置信区间（CI）。Kolmogorov–Smirnov检验用于确认数据的正态分布，学生的配对双尾t吨-进行了测试。E类)反转录-聚合酶链反应分析编码蛋白酶体成分的mRNA在ZsGreen阳性细胞和ZsGreen-negated阴性细胞中的表达与非选择性单层中的表达(虚线)，三个独立的实验。F类)流式细胞术将ZsGreen-high群体与ZsGreen阴性群体分选成96个平板后形成的球体数量。显示了四个独立实验的平均值±95%CI。G、 H（H）)来自荧光激活细胞的次级球体——分选的ZsGreen高（G和H）和ZsGreen阴性细胞(我,J型). 明亮区域的图像(左边)和ZsGreen荧光(正确的)显示了这两种人群的情况。
图2
图2
蛋白酶体活性低的癌细胞的肿瘤干细胞表型。A–C)U87MG-ZsGreen-cODC衍生神经球的胞质。ZsGreen阳性细胞对干细胞标记nestin呈阳性(红色但分化标记胶质纤维酸性蛋白（红色，B）和神经元特异性III类β-微管蛋白（红色）的TUJ-1染色呈阴性。D–F型)U87MG-ZsGreen-cODC衍生的神经球在胎牛血清中分化。细胞失去了ZsGreen和nestin（红色，D）的表达，但表达了分化标记GFAP（红色，E），并显示了神经元特异性III类β-微管蛋白（红色，F）的TUJ-1染色。用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚进行反染色(蓝色).
图3
图3
蛋白酶体活性低的癌细胞的致瘤性。A、 B类)ZsGreen阴性肿瘤来源于分选的球形细胞中的ZsGreen-阴性部分，肉眼或高倍镜下观察。C、 D类)ZsGreen阳性肿瘤是由于阴性部分中存在ZsGreen-阳性细胞的污染所致。
图4
图4
分次辐射对体内致癌细胞的影响。A–D)U87MG-ZsGreen-cODC–表达肿瘤，接受分次放射治疗，并在治疗前（A）、3-Gy放射暴露后（B）、5-×3-Gy辐射暴露后（C）或最后一次（D）72小时后成像。E、 F类)未治疗肿瘤（E）的高度放大视图，其中增殖的Ki67阳性细胞群表现出高蛋白酶体活性，只有少数低蛋白酶体活性（ZsGreen阳性）细胞，以及每日分数为3 Gy（F）的肿瘤，其中ZsGreen-阳性细胞的数量大幅度增加(克)Ki67阳性细胞百分比(H（H）). 4'，6-二氨基-2-苯基吲哚反染(蓝色). 显示了两个独立实验的平均值和95%置信区间（CI）。I–K型)表达胸腺嘧啶激酶融合蛋白、ZsGreen和小鼠鸟氨酸脱羧酶脱羧末端羧基端的U87MG细胞衍生肿瘤的小鼠，用更昔洛韦治疗（从植入后第12天开始，5次腹腔注射50 mg/kg[我]开始治疗后18天[J型]).K（K）)更昔洛韦治疗小鼠肿瘤的生长。肿瘤体积（mm3)用卡尺评估，显示为平均值±95%CI（每组5只小鼠）。
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