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比较研究
.2009年5月1日；315(8):1415-28.
doi:10.1016/j.yexcr.2009.02.002。 Epub 2009年2月14日。

肠内PKCalpha肿瘤抑制与细胞周期蛋白D1的转录和翻译抑制相关

玛丽贝思·A·皮兹 1, 奥尔加五世列昂蒂耶娃, 尼古拉斯·W·贝特曼, 约书亚·M·乌洛尼斯, 凯瑟琳·柯里, 大卫·W·Threadgill, 克劳斯·佩特·詹森, 西尔维·罗宾, 安娜·维西奇, 伦纳德·H·奥根利希特, 阿德里安·R·布莱克, 詹妮弗·D·布莱克
附属公司
比较研究

肠内PKCalpha肿瘤抑制与细胞周期蛋白D1的转录和翻译抑制相关

玛丽贝思·A·皮兹等。 Exp单元Res. .

摘要

PKC同工酶表达的改变和细胞周期蛋白D1的异常诱导是肠肿瘤发生的早期事件。先前的研究已经确定细胞周期蛋白D1是PKCα在未转化的肠细胞中抗增殖作用的主要靶点；然而，PKC信号和细胞周期蛋白D1在结肠癌中的联系尚待确定。目前的研究进一步表征了肠肿瘤中PKC同工酶的表达，并探讨了在一组结肠癌细胞系中恢复PKCalpha或PKCdelta的后果。与原发性肿瘤中PKC表达模式一致，结肠癌细胞系中PKCalpha和delta水平普遍降低，PKCbetaII升高，PKCepsilon表现出可变表达，从而建立了这些模型用于PKC信号分析的适用性。虽然结肠癌细胞对PKC激动剂对细胞周期蛋白D1水平的影响不敏感，但PKCalpha的恢复通过两种独立的机制下调了细胞周期蛋白D1。PKCalpha的表达持续地（a）通过一种新的转录机制降低了非转化细胞中cyclin D1的稳态水平，（b）重建了PKC激动剂激活翻译阻遏物4E-BP1并抑制cyclin D2翻译的能力。相反，PKCdelta对细胞周期蛋白D1稳态水平的影响适中且可变，并且不能恢复对PKC激动剂的反应性。值得注意的是，PKCalpha的表达通过部分依赖于cyclin D1缺陷的机制阻止了结肠癌细胞的锚定非依赖性生长，而PKCdelta的作用很小。PKCalpha的丢失及其再表达的影响与APC/β-catenin信号通路的状态或已知的基因改变无关，这表明它们是结肠肿瘤的一般特征。因此，PKCalpha是结肠肿瘤细胞中cyclin D1表达和凤尾鱼非依赖性细胞生长的一个强有力的负调控因子，这一发现为研究肠癌变过程中这种同工酶的频繁丢失提供了重要的视角。

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数字

图1
图1。PKC同工酶在肿瘤性肠组织和细胞系中的表达改变
（A）腺瘤（A）或肿瘤（T）及邻近正常隐窝（NC）和绒毛（V）/表面粘膜细胞PKCα表达的免疫组织化学分析亚太区最小值/+和亚太区1638小鼠（APC突变）、[25]、[26]氮氧甲烷处理的KK/HIJ小鼠（β-catenin突变）、[2]和APC/β-catening野生型pVillin-KRas公司V12G版本小鼠[28]和Muc2型-/-小鼠[29]。放大镜：100μm。PKCα广泛分布于正常增殖的肠隐窝细胞（NC）的细胞质中（可能呈非活性构象），主要位于质膜/正常有丝分裂后肠细胞（V）中活跃，而肿瘤细胞中没有PKCα。（B）人CRC细胞、非转化IEC-18和FHC细胞[在与CRC细胞（FHC-a）相同的培养基或ATCC完全培养基（FHC-b）中培养]中PKC同工酶的免疫印迹分析。CRC细胞中流动性更快的PKCα物种可能在Ser缺乏磷酸化657，酶上的启动位点之一（Leontieva和Black，未发表的数据）。PKCδ在CRC细胞中始终显示出不同的迁移模式。右下面板：PKCδ免疫印迹特异性的肽竞争分析。样品用抗PKCδ抗体或用封闭肽预孵育的抗PKCΔ抗体进行检测。数据代表≥3个独立实验。（C） 顶部面板：腺癌（A）和邻近正常粘膜（NM）/正常隐窝（NC）细胞PKCδ表达的免疫组织化学分析亚太区最小值/+和氮氧基甲烷处理的KK/HIJ小鼠。放大镜：100μm。下部面板：10例患者结肠肿瘤组织（T）和邻近正常结肠粘膜（N）提取物中PKCδ表达的免疫印迹分析。通过固绿染色（未显示）确认负载相等。
图1
图1。PKC同工酶在肿瘤性肠组织和细胞系中的表达改变
（A）腺瘤（A）或肿瘤（T）及邻近正常隐窝（NC）和绒毛（V）/表面粘膜细胞PKCα表达的免疫组织化学分析亚太区最小值/+和亚太区1638小鼠（APC突变）、[25]、[26]氮氧甲烷处理的KK/HIJ小鼠（β-catenin突变）、[2]和APC/β-catening野生型pVillin-KRas公司V12G版本小鼠[28]和Muc2型-/-小鼠[29]。放大镜：100μm。PKCα广泛分布于正常增殖的肠隐窝细胞（NC）的细胞质中（可能呈非活性构象），主要位于质膜/正常有丝分裂后肠细胞（V）中活跃，而肿瘤细胞中没有PKCα。（B）人CRC细胞、非转化IEC-18和FHC细胞[在与CRC细胞（FHC-a）相同的培养基或ATCC完全培养基（FHC-b）中培养]中PKC同工酶的免疫印迹分析。CRC细胞中流动性更快的PKCα物种可能在Ser缺乏磷酸化657，酶的启动位点之一（Leontieva和Black，未发表数据）。PKCδ在CRC细胞中始终显示出不同的迁移模式。右下面板：PKCδ免疫印迹特异性的肽竞争分析。样品用抗PKCδ抗体或用封闭肽预孵育的抗PKCΔ抗体进行检测。数据代表≥3个独立实验。（C） 顶部面板：腺癌（A）和邻近正常粘膜（NM）/正常隐窝（NC）细胞PKCδ表达的免疫组织化学分析亚太区最小值/+和氮氧基甲烷处理的KK/HIJ小鼠。放大镜：100μm。下部面板：免疫印迹分析10例患者结肠肿瘤组织（T）和邻近正常结肠粘膜（N）提取物中PKCδ的表达。通过固绿染色（未显示）确认负载相等。
图1
图1。PKC同工酶在肿瘤性肠组织和细胞系中的表达改变
（A）腺瘤（A）或肿瘤（T）及邻近正常隐窝（NC）和绒毛（V）/表面粘膜细胞PKCα表达的免疫组织化学分析亚太区最小值/+和亚太区1638小鼠（APC突变）、[25]、[26]氮氧甲烷处理的KK/HIJ小鼠（β-catenin突变）、[2]和APC/β-catening野生型pVillin-KRas公司V12G版本小鼠[28]和Muc2型-/-小鼠[29]。放大镜：100μm。PKCα广泛分布于正常增殖的肠隐窝细胞（NC）的细胞质中（可能呈非活性构象），主要位于质膜/正常有丝分裂后肠细胞（V）中活跃，而肿瘤细胞中没有PKCα。（B）人CRC细胞、非转化IEC-18和FHC细胞[在与CRC细胞（FHC-a）相同的培养基或ATCC完全培养基（FHC-b）中培养]中PKC同工酶的免疫印迹分析。CRC细胞中流动性更快的PKCα物种可能在Ser缺乏磷酸化657，酶的启动位点之一（Leontieva和Black，未发表数据）。PKCδ在CRC细胞中始终显示出不同的迁移模式。右下面板：PKCδ免疫印迹特异性的肽竞争分析。样品用抗PKCδ抗体或用封闭肽预孵育的抗PKCΔ抗体进行检测。数据代表≥3个独立实验。（C） 顶部面板：腺癌（A）和邻近正常粘膜（NM）/正常隐窝（NC）细胞PKCδ表达的免疫组织化学分析亚太区最小值/+和氮氧甲烷处理的KK/HIJ小鼠。放大镜：100μm。下部面板：免疫印迹分析10例患者结肠肿瘤组织（T）和邻近正常结肠粘膜（N）提取物中PKCδ的表达。通过固绿染色（未显示）确认负载相等。
图2
图2。PKCα抑制CRC细胞周期蛋白D1蛋白表达
（A）如图所示，对用20 moi LacZ、PKCα或PKCδ腺病毒（RKO为150 moi）感染的CRC细胞进行免疫印迹分析。数据表示>3个独立实验；两个实验（E.1和E.2）证明了结果的一致性。（B）感染20 moi LacZ、20 moi PKCα、500 moi（kdPKCα1）或700 moi（kdPKC al2）kdPKC-α腺病毒的DLD-1细胞的免疫印迹分析（增加的moi补偿了激酶死亡酶的不稳定性[21]）。（C）转导（20 moi）IEC-18细胞的免疫印迹分析。
图2
图2。PKCα抑制CRC细胞周期蛋白D1蛋白表达
（A）如图所示，对用20 moi LacZ、PKCα或PKCδ腺病毒（RKO为150 moi）感染的CRC细胞进行免疫印迹分析。数据表示>3个独立实验；两个实验（E.1和E.2）证明了结果的一致性。（B）用20 moi LacZ、20 moi PKCα、500 moi（kdPKCα1）或700 moi（kdPKCα2）kdPKCα腺病毒感染的DLD-1细胞的免疫印迹分析（增加的moi补偿了激酶死亡酶的不稳定性[21]）。（C）转导（20 moi）IEC-18细胞的免疫印迹分析。
图3
图3。PKCα诱导的细胞周期蛋白D1的抑制独立于异常的β-catenin信号传导，并可能受PKCα亚细胞分布的调节
（A）用100 nM非沉默或β-catenin siRNA转染DLD-1和HCT116细胞，72小时后感染20 moi LacZ或PKCα腺病毒。左侧面板：腺病毒感染后48小时HCT116细胞的免疫印迹分析。右侧面板：量化2（DLD-1）或3（HCT116）实验的细胞周期蛋白D1表达（归一化为肌动蛋白）（平均值±标准偏差）。（B）免疫荧光检测PKCα转导的HCT116（20 moi）和RKO细胞（150 moi）中的PKCα。箭头：膜染色。右侧面板：免疫印迹分析证实腺病毒感染后这些细胞中PKCα的表达水平相似。数据代表≥2个独立实验。
图3
图3。PKCα诱导的细胞周期蛋白D1的抑制独立于异常的β-catenin信号传导，并可能受PKCα亚细胞分布的调节
（A）用100 nM非沉默或β-catenin siRNA转染DLD-1和HCT116细胞，72小时后感染20 moi LacZ或PKCα腺病毒。左侧面板：腺病毒感染后48小时HCT116细胞的免疫印迹分析。右侧面板：量化2（DLD-1）或3（HCT116）实验的细胞周期蛋白D1表达（归一化为肌动蛋白）（平均值±标准偏差）。（B）免疫荧光检测PKCα转导的HCT116（20 moi）和RKO细胞（150 moi）中的PKCα。箭头：膜染色。右侧面板：免疫印迹分析证实腺病毒感染后这些细胞中PKCα的表达水平相似。数据代表≥2个独立实验。
图4
图4。PKCα通过转录抑制降低细胞周期蛋白D1稳态水平
（A）PKCα抑制细胞周期蛋白D1 mRNA的积累。上部面板：腺病毒转导细胞中cyclin D1 mRNA的Northern blot分析。数字显示PKCα表达细胞相对于LacZ转导细胞的cyclin D1 mRNA水平（归一化为28S rRNA）（平均值±s.e.）。下部面板：感染DLD-1细胞的Northern blot分析如图2B所示。（B）用指示的细胞周期蛋白D1启动子萤光素酶报告构建体转染LacZ或PKCα转导的DLD-1细胞，24小时后测定萤光素酶活性（相对于LacZ转导的细胞表达）。**与LacZ控制显著不同(P（P）<0.005). 数据代表≥3个独立实验。
图4
图4。PKCα通过转录抑制降低细胞周期蛋白D1稳态水平
（A）PKCα抑制细胞周期蛋白D1 mRNA的积累。上部面板：腺病毒转导细胞中cyclin D1 mRNA的Northern blot分析。数字显示PKCα表达细胞相对于LacZ转导细胞的cyclin D1 mRNA水平（归一化为28S rRNA）（平均值±s.e.）。下部面板：感染DLD-1细胞的Northern blot分析如图2B所示。（B）用所示的cyclin D1启动子-荧光素酶报告子构建物转染LacZ或PKCα转导的DLD-1细胞，24小时后测定荧光素酶活性（相对于LacZ转导的细胞表达）。**与LacZ控制显著不同(P（P）<0.005). 数据代表≥3个独立实验。
图5
图5。PKCα是PMA诱导CRC细胞周期蛋白D1下调和cap依赖性翻译抑制所必需的
（A）IEC-18细胞周期蛋白D1的免疫印迹分析(左侧面板)或LacZ转导的CRC细胞(右侧面板)用100 nmol/L PMA（P）或载体（EtOH，E）处理。（B）用PKCα或PKCδ腺病毒转导并用PMA或乙醇处理2h的CRC细胞的免疫印迹分析。（C）用PMA或载体处理未转导（UT）IEC-18和DLD-1细胞以及LacZ-或PKCα转导的DLD-1电池2小时，并对总Thr和非Thr磷酸进行免疫印迹464E-BP1。经LY294002（LY）（50μmol/L，30 min）处理的DLD-1细胞作为4E-BP1活化的阳性对照。箭头表示4E-BP1磷酸化形式。（D）用PMA或载体处理2小时后，对PKCα（20 moi）-或kdPKCα-转导的DLD-1细胞中的细胞周期蛋白D1和总4E-BP1进行免疫印迹分析。数据表示≥3个独立实验。
图5
图5。PKCα是PMA诱导CRC细胞周期蛋白D1下调和cap依赖性翻译抑制所必需的
（A）IEC-18细胞周期蛋白D1的免疫印迹分析(左侧面板)或LacZ转导的CRC细胞(右侧面板)用100nmol/LPMA（P）或载体（EtOH，E）处理。（B）用PKCα或PKCδ腺病毒转导并用PMA或乙醇处理2h的CRC细胞的免疫印迹分析。（C）用PMA或载体处理未转导（UT）IEC-18和DLD-1细胞以及LacZ-或PKCα转导的DLD-1电池2小时，并对总Thr和非Thr磷酸进行免疫印迹464E-BP1。经LY294002（LY）（50μmol/L，30 min）处理的DLD-1细胞作为4E-BP1活化的阳性对照。箭头表示4E-BP1磷酸形式。（D）用PMA或载体处理2小时后，对PKCα（20 moi）-或kdPKCα-转导的DLD-1细胞中的细胞周期蛋白D1和总4E-BP1进行免疫印迹分析。数据表示≥3个独立实验。
图5
图5。PKCα是PMA诱导CRC细胞周期蛋白D1下调和cap依赖性翻译抑制所必需的
（A）IEC-18细胞周期蛋白D1的免疫印迹分析(左侧面板)或LacZ转导的CRC细胞(右侧面板)用100 nmol/L PMA（P）或载体（EtOH，E）处理。（B）用PKCα或PKCδ腺病毒转导并用PMA或乙醇处理2h的CRC细胞的免疫印迹分析。（C）用PMA或载体处理未转导（UT）IEC-18和DLD-1细胞以及LacZ-或PKCα转导的DLD-1电池2小时，并对总Thr和非Thr磷酸进行免疫印迹464E-BP1。经LY294002（LY）（50μmol/L，30 min）处理的DLD-1细胞作为4E-BP1活化的阳性对照。箭头表示4E-BP1磷酸形式。（D）用PMA或载体处理2小时后，对PKCα（20 moi）-或kdPKCα-转导的DLD-1细胞中的细胞周期蛋白D1和总4E-BP1进行免疫印迹分析。数据表示≥3个独立实验。
图6
图6。PKCα和PKCδ对CRC细胞非锚定生长的抑制作用
（A）如图所示，用LacZ、PKCα或PKCδ腺病毒感染CRC细胞，并用软琼脂糖包被。相对于LacZ对照，提出了菌落形成的量化（≥2个独立实验的平均值±s.e.）。所有转导PKCα的样品与转导LacZ的对照组有显著差异(P（P）<0.05），RKO细胞除外。（B）用LacZ、PKCα或kdPKCα腺病毒感染DLD-1细胞，并进行免疫印迹分析(左侧面板)或软琼脂糖集落形成分析(右侧面板). 数据表示两个独立实验的平均值（±s.e.）。（C）用PKCα、LacZ和cyclin D1腺病毒的指示组合感染DLD-1和HCT116细胞，并进行免疫印迹分析(左侧面板)或在软琼脂糖中形成菌落（定量如A，右侧面板). 数据表示3个独立实验的平均值±s.e。使用20个moi cyclin D1腺病毒获得了类似的结果。
图6
图6。PKCα和PKCδ对CRC细胞锚定非依赖性生长的不同抑制作用
（A）如图所示，用LacZ、PKCα或PKCδ腺病毒感染CRC细胞，并用软琼脂糖包被。相对于LacZ对照，提出了菌落形成的量化（≥2个独立实验的平均值±s.e.）。所有转导PKCα的样品与转导LacZ的对照组有显著差异(P（P）<0.05），RKO细胞除外。（B）DLD-1细胞感染LacZ、PKCα或kdPKCα腺病毒，并进行免疫印迹分析(左侧面板)或软琼脂糖集落形成分析(右侧面板). 数据表示两个独立实验的平均值（±s.e.）。（C）用PKCα、LacZ和cyclin D1腺病毒的指示组合感染DLD-1和HCT116细胞，并进行免疫印迹分析(左侧面板)或在软琼脂糖中形成菌落（定量如A，右侧面板). 数据表示3个独立实验的平均值±s.e。使用20个moi cyclin D1腺病毒获得了类似的结果。
图7
图7。PKCα缺乏和cyclin D1表达增加是肠肿瘤和CRC细胞系的特征，与APC/β-catenin突变状态无关
（A）腺瘤（A）和邻近“正常”粘膜/隐窝（NM；NC）中PKCα和细胞周期蛋白D1的免疫组织化学分析亚太区最小值/+小鼠、经偶氮甲烷处理的KK/HIJ和A/J小鼠和pVillin-KRas公司V12G版本老鼠。箭头：“正常”隐窝细胞中的细胞周期蛋白D1染色。放大镜：100μm。（B）CRC细胞和非转化IEC-18细胞中PKCα和细胞周期蛋白D1的Western blot分析。线条表示同一凝胶中的车道重新组合。
图7
图7。PKCα缺乏和cyclin D1表达增加是肠肿瘤和CRC细胞系的特征，与APC/β-catenin突变状态无关
（A）腺瘤（A）和邻近“正常”粘膜/隐窝（NM；NC）中PKCα和细胞周期蛋白D1的免疫组织化学分析亚太区最小值/+小鼠、经偶氮甲烷处理的KK/HIJ和A/J小鼠和pVillin-KRas公司V12G版本老鼠。箭头：“正常”隐窝细胞中的细胞周期蛋白D1染色。放大棒：100μm。（B）CRC细胞和非转化IEC-18细胞中PKCα和细胞周期蛋白D1的Western blot分析。线条表示同一凝胶中的车道重新组合。
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