Reassessment of CXCR4 chemokine receptor expression in human normal and neoplastic tissues using the novel rabbit monoclonal antibody UMB-2

doi:10.1371/journal.pone.0004069

.2008;3（12）：e4069。

doi:10.1371/journal.pone.0004069。 Epub 2008年12月31日。

用新型兔单克隆抗体UMB-2重新评估CXCR4趋化因子受体在人正常组织和肿瘤组织中的表达

托马斯·菲舍尔¹, 法尔科·纳格尔, 斯特凡·雅各布斯, 拉尔夫·斯图姆, 斯特凡·舒尔茨

附属公司

采购管理信息： 19116653
预防性维修识别码： PMC2605258型
内政部： 10.1371/journal.pone.0004069

用新型兔单克隆抗体UMB-2重新评估CXCR4趋化因子受体在人正常组织和肿瘤组织中的表达

托马斯·菲舍尔等。公共科学图书馆一号. 2008.

.2008;3（12）：e4069。

doi:10.1371/journal.pone.0004069。 Epub 2008年12月31日。

作者

托马斯·菲舍尔¹, 法尔科·纳格尔, 斯特凡·雅各布斯, 拉尔夫·斯图姆, 斯特凡·舒尔茨

附属

¹德国瓦茨堡朱利叶斯·马西米利安大学药理学系。

采购管理信息： 19116653
预防性维修识别码： PMC2605258型
内政部： 10.1371/journal.pone.0004069

摘要

背景：CXCR4趋化因子受体调节癌细胞向特定转移部位的迁移和归巢。CXCR4受体状态的测定将为疾病预后和可能的治疗干预提供预测信息。然而，以前使用特征不佳的小鼠单克隆抗体或兔多克隆抗体定位CXCR4的尝试产生了主要的核染色和偶尔的细胞质染色，但未能识别真正的细胞表面受体。

方法/主要发现：在本研究中，我们使用CXCR4缺陷小鼠的转染细胞和组织广泛鉴定了新型兔抗CXCR4单克隆抗体（克隆UMB-2）。通过CXCR4转染细胞的细胞表面染色证明UMB-2的特异性；激动剂暴露后CXCR4免疫染色易位；在CXCR4表达细胞匀浆的Western blot中检测到M（r）38000-43000处的宽带迁移；选择性检测CXCR4+/+而非CXCR4-/-小鼠组织中的受体；通过UMB-2及其免疫肽的预吸附来取消组织免疫染色。在福尔马林固定、石蜡包埋的人类肿瘤组织中，UMB-2对肿瘤细胞亚群进行了高效的质膜染色，这些肿瘤细胞通常分布在整个肿瘤中。对小鼠单克隆抗体12G5和其他常用的商用抗体的比较分析表明，在其他相同条件下，这些抗体都不能检测到CXCR4。

结论/意义：因此，在常规组织病理学检查中，兔单克隆抗体UMB-2在评估多种人类肿瘤中CXCR4受体状态方面可能具有重要价值。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。使用转染细胞鉴定兔单克隆抗体UMB-2。**
A类，抗CXCR4抗体特异性的蛋白质印迹分析。在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离来自稳定转染以表达CCR7或CXCR4的HEK-293细胞的膜制剂，并将其吸附在硝化纤维素膜上。然后用亲和纯化的1µg/ml抗CCR7{1188}或抗CXCR4{UMB-2}杂交瘤上清液以1∶100的稀释度培养膜。使用增强化学发光法开发印迹。注意，UMB-2仅在CXCR4中检测到预期分子量的条带，但在CCR7转染细胞中未检测到。另外两个实验给出了类似的结果。*纵坐标*、蛋白质分子量标记的迁移(*M（M）* _第页×10⁻³).B类通过转染细胞的免疫荧光染色鉴定UMB-2。表达CCR7或CXCR4的HEK-293细胞未暴露或暴露于100 ng/ml MIP-3或100 ng/ml SDF-1 30 min，随后固定并用1µg/ml抗CCR7{1188}或抗CXCR4{UMB-2}以1∶100的稀释度进行免疫荧光染色。注意，UMB-2仅在CXCR4细胞的质膜水平上检测到显著的免疫荧光，但在CCR7表达细胞中没有检测到，SDF-1暴露诱导CXCR4受体免疫染色从质膜快速转移到细胞液中。显示了三个独立实验之一的代表性结果。比例尺，20µm。

**图2。利用CXCR4缺陷小鼠鉴定兔单克隆抗体UMB-2。**
A类使用胚胎第17天（E17）制备的CXCR4缺陷小鼠（CXCR4−/−）脑匀浆和出生后第90天制备的野生型同窝鼠（CXCR4+/+）以及成年CXCR4++脑，Western blot分析UMB-2的特异性。注意，UMB-2选择性地检测CXCR4+/+小鼠E17处的CXCR4受体，并且不会与CXCR4−/−小鼠组织提取物中存在的其他蛋白质发生交叉反应。蛋白质分子量标记的迁移(*M（M）* _第页×10⁻³)如右图所示。*B–E类*，通过免疫组化染色对CXCR4缺陷小鼠（CXCR4−/−，*左侧面板*)和它们的野生型同胞（CXCR4+/+，*右侧面板*). 请注意，UMB-2选择性检测CXCR4受体，并且不会与CXCR4−/−小鼠组织切片中的其他蛋白质发生交叉反应。F类皮层切向迁移神经元的质膜上有明显的CXCR4受体免疫染色。CTX，皮层；GE，神经节隆起；CPu，尾状壳核；OX，视交叉；3V，第三脑室；MZ，边缘带；CP，皮质板；IZ，中间带；SVZ，室下区；VZ，心室区。比例尺，B = C类 = 500µm，直径 = E类 = 100µm，F = 50微米。

**图3。人福尔马林固定和石蜡包埋组织中的UMB-2免疫组织化学染色。**
A类–*K（K）*，多种人类正常组织和肿瘤组织的UMB-2免疫组织化学染色。切片脱蜡，在柠檬酸中微波加热，并与UMB-2以1∶10的稀释度孵育。切片依次用生物素化抗兔IgG和AB溶液处理。然后用二氨基联苯胺对切片进行显影，并用苏木精进行轻微复染。注意，UMB-2在包括乳腺癌（a）、子宫内膜癌（B）、宫颈癌（C）、卵巢癌（D）、胃癌（E）、胰腺癌（F）、结肠癌（G）和恶性嗜铬细胞瘤（J）在内的多种人类肿瘤的肿瘤细胞亚群的质膜上检测到CXCR4受体。在几乎所有这些病例中，UMB-2免疫反应性肿瘤细胞在整个肿瘤中呈现出不均匀分布。UMB-2在前列腺癌（H）中显示出明显的细胞质染色。在胶质母细胞瘤中，UMB-2主要在肿瘤血管内皮细胞的质膜上检测到CXCR4受体（I）。UMB-2还检测到CXCR4受体*束状带*肾上腺皮质（K）。插入C，肽吸附控制。I中的箭头，肿瘤血管。C、胶囊；Z.g.，肾小球带；Z.f.，束状带；Z.r.、网状带、比例尺、A = B类 = C类 = D类 = E类 = F类 = G公司 = H（H） = 我 = J型 = K（K） = 50微米，K = 100微米。

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