Lack of cytochrome c in mouse fibroblasts disrupts assembly/stability of respiratory complexes I and IV

doi:10.1074/jbc.M805972200

.2009年2月13日；284(7):4383-91.

doi:10.1074/jbc。M805972200。 Epub 2008年12月15日。

小鼠成纤维细胞缺乏细胞色素c会破坏呼吸复合物I和IV的组装/稳定性

乌玛·D·万帕蒂¹, 韩仙林, 卡洛斯·托·莫雷斯

附属公司

PMID： 19075019
预防性维修识别码： PMC2640958型
内政部： 10.1074/jbc。M805972200型

小鼠成纤维细胞缺乏细胞色素c会破坏呼吸复合物I和IV的组装/稳定性

乌玛·D·万帕蒂等。生物化学杂志. 2009.

.2009年2月13日；284(7):4383-91.

doi:10.1074/jbc。M805972200。 Epub 2008年12月15日。

作者

乌玛·D·万帕蒂¹, 韩仙林, 卡洛斯·托·莫雷斯

附属

¹美国佛罗里达州迈阿密市迈阿密大学米勒医学院神经病学系和细胞生物学与解剖学系，邮编33136。

PMID： 19075019
预防性维修识别码： PMC2640958型
内政部： 10.1074/jbc。M805972200型

摘要

细胞色素c（cyt c）是一种含血红素的蛋白质，参与呼吸链中的电子传递，并在凋亡级联中作为信号分子。在这里，我们讨论了去除哺乳动物细胞色素c对哺乳动物细胞中呼吸复合物完整性的影响。来自cyt c基因敲除小鼠细胞的线粒体缺乏完全组装的复合物I和IV，并降低了复合物III的水平。cyt c的氧化还原缺陷突变体无法拯救复合物I或IV的水平。我们发现cyt c与复合物IV和呼吸超复合物都相关，为配合物IV的组装/稳定性中cyt c的需求提供了潜在机制。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**cyt的表达和定位*c（c）*在成纤维细胞中。**对照组（LF）、dKO（L3）、WT-cyt的免疫染色*c（c）*重新引入（CL1）和W60S突变型cytc（c）用cyt重新导入（CL18）细胞*c（c）*抗体。细胞与MitoTracker红共同染色以确认线粒体定位。

**图2。**
**细胞周期紊乱的小鼠成纤维细胞*c（c）*（体细胞和睾丸）等位基因是OXPHOS缺陷的。** A类，控制（LF），cytc（c）dKO公司（L3、L4和L7），野生型cytc（c）重新引入cDNA（CL1和CL15），和突变型cytc（c）分析cDNA重新导入（CL18）的完整细胞用于KCN敏感氧气消耗。所有细胞系也进行了分析抗坏血酸-TMPD呼吸的比率直接发送至cytc（c）)内源性呼吸（从复合物I开始和II）。细胞周期*c（c）*dKO细胞和重新引入突变胞苷的细胞*c（c）*cDNA没有呼吸。B类和D类，呼吸用分光光度法测定配合物（III和IV）的活性。在所有样品中测量柠檬酸合成酶活性(C类)作为线粒体水平的测量。细胞周期*c（c）*dKO细胞和那些重新引入W60S突变体胞苷*c（c）*cDNA（CL18和CL25）缺失复合物IV和减少了复合物III的活性。

**图3。**
**细胞周期*c（c）*-缺陷细胞缺乏氧磷复合物I和IV。** A类不同细胞线粒体的Western分析使用抗cyt抗体的细胞系*c（c）*、Ndufa9、COX1、SDH、，核心2和ATP酶-β。VDAC1抗体作为负荷对照。细胞周期*c（c）*dKO细胞（L3和L4）缺乏COX1。B类，BN-PAGE为在4–13%的凝胶上进行。将蛋白质转移到PVDF上膜，并用针对不同复合物产生的抗体进行探测亚单位，即Ndufa9（复合物I）、Core2（复合物III）、COX1（复合物IV）、，和ATP酶-β（复合物V）。*CI、CIII、CIV*、和*个人简历*是复合物I、III、IV和V。细胞周期*c（c）*dKO电池（L3）和那些重新引入W60S突变型cyt的人*c（c）*cDNA（CL18）缺失复合物I和IV。复合物I在CL1和CL15中也显著减少。C类，对照（LF）线粒体的二维BN-PAGE抗cyt抗体的西方分析*c（c）*和复合物I（NDUFA9）、III（核心2）和IV（COX 1）。

**图4。**
**配合物I和IV未合成或在胞苷中极不稳定*c（c）*dKO细胞。**细胞被标记为[³⁵S] 蛋氨酸和半胱氨酸，然后分别追逐2、4和24小时。裂解物在SDS-PAGE上对来自不同细胞系的(A类).用BN-PAGE分析LF和L3（dKO）的裂解产物(B类)和进行放射自显影。在C类，中所示的相同样本B类转移到膜上并用抗体进行探测针对不同的复合亚单位，即Ndufa9（复合物I）、COXI（复合物IV）和ATP酶-β（复合物V）。VDAC1和CII（Fp）抗体用作加载控件。

**图5。**
**突变cytc（c）不在中正常本地化线粒体。** A类来自LF、CL1和用蛋白酶K处理CL18，并使用抗胞苷抗体*c（c）*、COX1（内膜蛋白）、COXVb（内层膜蛋白）和HSP60（基质蛋白）。B类，250μg来自LF、L3（dKO）、CL1和CL18的线粒体在锂上分解十二烷基硫酸酯-PAGE，印迹，血红素染色检测线粒体*c（c）*-细胞色素型。马cytc（c）（200 pmol，Sigma）作为阳性对照。

**图6。**
缺乏cyt的线粒体的脂质组成*c（c）*.心磷脂总量的定量(氯)和三酰甘油(标签)电喷雾在不同细胞系中的含量如补充图所示，进行电离质谱分析。第5章A类和S5B类。结果表示为与对照细胞中的相应脂质(低频).

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