Secreted trefoil factor 2 activates the CXCR4 receptor in epithelial and lymphocytic cancer cell lines

doi:10.1074/jbc.M804935200

.2009年2月6日；284(6):3650-62.

doi:10.1074/jbc。M804935200。 Epub 2008年12月8日。

分泌的三叶因子2激活上皮和淋巴细胞癌细胞系中的CXCR4受体

Zinaida Dubeykovskaya公司¹, 亚历山大·杜贝科夫斯基, 乔尔·索拉尔·科恩, 蒂莫西·C·王

附属公司

PMID： 19064997
预防性维修识别码：项目经理2635042
内政部： 10.1074/jbc。M804935200型

分泌的三叶因子2激活上皮和淋巴细胞癌细胞系中的CXCR4受体

Zinaida Dubeykovskaya公司等。生物化学杂志. 2009.

.2009年2月6日；284(6):3650-62.

doi:10.1074/jbc。M804935200之间。 Epub 2008年12月8日。

作者

齐奈达·杜贝伊科夫斯卡娅¹, 亚历山大·杜贝科夫斯基, 乔尔·索拉尔·科恩, 蒂莫西·C·王

附属

¹美国纽约州纽约市哥伦比亚大学医学中心医学系，邮编：10032。

PMID： 19064997
预防性维修识别码：项目经理2635042
内政部： 10.1074/jbc。M804935200型

摘要

分泌型三叶因子家族2（TFF2）蛋白通过加强和稳定粘蛋白凝胶、刺激上皮修复和抑制相关炎症，有助于保护胃肠粘膜免受损伤。虽然三叶因子已被证明能激活信号通路，但没有细胞表面受体与三叶肽信号直接相关。在这里，我们证明了TFF2肽通过CXCR4趋化因子受体在癌细胞系中激活信号的能力。我们发现小鼠和人类TFF2蛋白（约0.5微米）激活淋巴母细胞Jurkat细胞中的Ca2+信号，这些信号可以通过受体脱敏（使用SDF-1α）或使用特异性拮抗剂AMD3100或抗CXCR4抗体进行预处理而消除。TFF2预处理Jurkat细胞可降低Ca2+升高和对SDF-1α的趋化反应。此外，CXCR4阴性的胃上皮细胞系AGS在表达CXCR4受体后对TFF2治疗产生高度反应。TFF2诱导胃癌和胰腺癌细胞KATO III和AsPC-1中丝裂原活化蛋白激酶的激活也依赖于CXCR4受体的存在。最后，我们证明了TFF2蛋白对表达CXCR4的AGS胃癌细胞株的显著增殖作用。总的来说，这些数据确定CXCR4是TFF2的真正信号受体，并表明TFF2可能通过一种机制调节体内免疫和致瘤反应。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**内源性和外源性TFF2抑制Jurkat细胞趋化性SDF-1型**α.顶部，Jurkat细胞携带空逆转录病毒（pMIG；*实心钢筋*)或表达mTFF2的细胞；*空的钢筋*)在趋化试验中检测到指定浓度SDF-1的相对迁移细胞数与输入计算细胞数（平均值±S.E.），并显示在*纵坐标*.统计上的显著差异(第页<0.003）应变之间的星号(^*).底部，在趋化性试验中测试亲代Jurkat细胞SDF-1α（12.5牛顿米)如上所述，但在各种重组mTFF2在移植前（15分钟）和移植过程中的浓度两个腔室。统计学显著差异(^*,第页< 0.05;^**,第页<0.002）指示细胞。

**图2。**
**内源性TFF2降低Ca²⁺低辐射引起的通量Jurkat细胞中SDF-1α的剂量不高。**Jurkat pMIG公司(*蓝色线*)和Jurkat pMIG-mTFF2(绿线)细胞被加载印度-1（Ca²⁺-传感染料）并测试细胞内钙²⁺水平（蓝色/紫色荧光比率）5n刺激米(顶部)或50 n米(底部)流式细胞术检测SDF-1α4分钟。相同的单元格缓冲区挑战如下所示红色（pMIG）或黑色（pMIG-mTFF2）线(基线). 趋化因子（或缓冲液）在指定的时间点添加箭头. The顶部和底部数字表示同一实验的数据。*DAPI公司*，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。

**图3。**
**重组小鼠TFF2刺激Ca²⁺Jurkat流量细胞。** 顶部，细胞装载Indo-1染料并测试钙²⁺刺激后流式细胞仪的流量(箭头)带有SDF-1α（12.5 n米)或mTFF2（300和600n米)或缓冲器(*BL公司*)持续4分钟。底部，加利福尼亚州²⁺通量用不同剂量的小鼠刺激(*菱形的*)或人类(广场)重组TFF2肽在Jurkat细胞中通过流式细胞术同上。钙的最大增加²⁺水平高于各自的基础水平与测试浓度为展示。绘制的趋势线是使用Microsoft Excel创建的。*DAPI公司*，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。

**图4。**
**三叶肽和SDF-1激活不同的信号通路Jurkat细胞。**细胞在无血清培养基中饥饿过夜，然后用mTFF2（600 n）刺激米)或SDF-1α（12.5 n米)对于所指示的时间。蛋白质提取物的制备和分析通过Western blot激活/磷酸化ERK1/2或AKT（Thr-308）激酶使用相应抗体进行分析。带防盗功能的最终检测用相应的膜进行ERK1/2或抗总AKT抗体确保样品装载均匀。*帕克特*，磷酸-AKT；*pERK公司*,磷酸-ERK。

**图5。**
**TFF2-和SDF-1依赖性的同源和异源脱敏Jurkat细胞中的钙信号传导。** A类，个细胞装载了钙²⁺-感应染料，并用mTFF2（600n个米；顶部)或SDF-1（12.5 n米；底部)最后用胃泌素治疗(*天然气₁₇*; 100n个米)在指定的时间点(箭头)在每个病例后测量细胞钙²⁺按流量分级细胞术（～2000个细胞/秒）10分钟。B类，加利福尼亚州²⁺通量是测量单位为A类，但用12.5n个米SDF-1α和600 n米mTFF2型(顶部)或恶习反之亦然(底部)胃泌素最后刺激（100n米).数据显示为FlowJo软件创建的曲线。*DAPI公司*,4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。

**图6。**
**CXCR4受体的中和阻断TFF2诱导的Ca²⁺Jurkat细胞中的通量。**细胞负载钙²⁺-传感染料是否用12G5抗体（5γ/ml）或拮抗剂AMD3100治疗(0.6 μ米)用SDF-1α（12.5）刺激前15分钟n个米)或mTFF2（600 n米). 钙离子的测量用流式细胞术检测4分钟后的钙水平²⁺测定了每种刺激（有/无治疗）的水平，如图所示这个*横坐标*。所示的治疗并未影响健壮性钙²⁺胃泌素反应(*天然气₁₇*). 数据所示（平均值±S.E.）代表了从两个数据中获得的类似数据其他实验。达皮,4′，6-二脒基-2-苯基吲哚。

**图7。**
**TFF2激活AGS细胞中CXCR4依赖的信号转导表达趋化因子受体。**AGS公司(天)或AGS/CXCR4-GFP(*A–C*)隔夜剥夺细胞血清并测试ERK1/2的磷酸化(*A、 B类*、和天)或AKT(C类和天)蛋白印迹法检测激酶的磷酸特异性SDF-1α刺激后的抗体（12.5 n米)或mTFF2（600牛顿米). 在试验结束时，用针对总激酶的相应抗体，以确保均匀的样本装载。在B类用AMD3100（0.6）预处理AGS/CXCR4细胞μ米)、抗CXCR4抗体（5或10γ/ml）或同型刺激前15分钟匹配抗体（IgG；10γ/ml）。*帕克特*，磷酸-AKT；*pERK公司*，磷酸-ERK；*未设置。*,无刺激。

**图8。**
**TFF2通过CXCR4刺激AGS/CXCR4细胞增殖受体。**AGS公司(A类)或AGS/CXCR4(B类)电池（12×10^三细胞/孔）在无血清DMEM中培养三倍（+0.1%BSA），在指定的温度下有或没有TFF2、SDF-1或EGF浓度。用WST-8测定活细胞数72小时后的生长检测试剂盒。每个酒吧表示平均值±三个独立测量的S.E。具有统计学意义的刺激细胞因子促进生长(与控制）由指示星号(^*)*在上面*各自的钢筋(^*,第页< 0.05;^**,第页< 0.01).C类，用拮抗剂AMD3100中和CXCR4受体(*AMD公司*; 0.6 μ米)或抗CXCR4抗体(*12国集团5*；10γ/ml）消除TFF2的生长刺激作用（600牛顿米)和SDF-1（12.5 n米)在AGS/CXCR4细胞中。这个生长效应测量如下A类.一个星号标记a统计上显著的阻塞效应(第页<0.05）未经处理但受到刺激的细胞。天，TFF2（600 n米),SDF-1（12.5牛顿米)和EGF（10 ng/ml）刺激布尔德乌尔德(*溴化铀*)在AGS/CXCR4细胞中。细胞被电镀并生长为但新合成DNA中的BrdUrd掺入在21小时后进行评估之后如“实验程序”所述。每个酒吧代表三个重复的平均值±S.E决定。(^*,第页< 0.05与控制值）。

**图9。**
**TFF2激活癌细胞中CXCR4信号，天然表达趋化因子受体。**胃KATO III(A类和C类)和胰腺AsPC-1(B类和天)对细胞进行ERK1/2和SDF-1刺激后的AKT（Thr-308）磷酸化（12.5n米)或mTFF2（600 n米)如上所示*正确的*每个面板的通过Western blot。C类和天，CXCR4中和AMD3100受体（0.6μ米)或特定（12G5；10γ/ml）但不是同种抗体（IgG；10γ/ml）通过mTFF2（600牛顿米; 5分钟）在KATO III中(C类)或AsPC-1(天)单元格。*帕克特*，磷酸-AKT；*pERK公司*,磷酸-ERK。

**图10。**
**TFF2抑制抗CXCR4 2B11抗体与Jurkat的结合细胞。**细胞与藻红蛋白标记的抗CXCR4孵育(*第2-5行*)，12G5(A类)，或2B11(B类)或同型匹配(*第1行，着色区域*)抗体存在时不同浓度的TFF2(*顶部面板*)或SDF-1(*中间的面板*)在4°C下保持1小时。在潜伏期结束时，细胞清洗后用流式细胞仪进行分析。存在时抗体结合配体的浓度如下所示：inA类和B类(*顶部面板*):*第2行*，无TFF2；*第3行*,12 μ米TFF2；*第4行*，60微米米TFF2；在里面A类和B类(*中间面板*):*第2行*，无SDF-1；*第3行*，5个米SDF-1；*第4行*，25牛顿米SDF-1；*第5行*，125牛顿米SDF-1。为了清楚起见，并非所有获得的曲线都显示在顶部和*中间的面板。底部面板*(A类和B类)总结中位数荧光强度(*货币金融机构*)计算的细胞标记数量使用来自顶部和*中间面板*.显示的数据（平均值±标准偏差）是三个独立实验的代表。

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