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.2009年2月；83(3):1350-8.
doi:10.1128/JVI.02169-08。 Epub 2008年11月26日。

BK病毒进入和分解过程中的早期事件

蒙西江 1, 约翰娜·阿本德, 蔡比利（Billy Tsai）, 迈克尔·J·帝国
附属公司

BK病毒进入和拆卸期间的早期事件

蒙西江等。 J维罗尔. 2009年2月.

摘要

BK病毒（BKV）是一种无包膜、普遍存在的人类多瘤病毒，在健康个体中持续感染。然而，它可以在免疫抑制患者中重新激活，并导致严重疾病，包括多瘤病毒肾病。BKV的进入和拆卸机制尚未明确。在本报告中，我们描述了原代人肾近曲小管上皮细胞（RPTE）中BKV感染的早期事件，RPTE细胞是BKV的自然宿主细胞。我们的结果表明，在进入RPTE细胞的早期，BKV侵染涉及酸性环境，然后沿着微管网络运输到达内质网（ER）。观察到主要衣壳蛋白VP1的独特二硫键异构化和切割模式，这也受到pH值变化和向内质网运输中断的影响。Derlin-1是一种对某些错误折叠蛋白进行反向易位所需的内质网蛋白，其显性阴性形式可抑制BKV感染。与此一致的是，我们检测到Derlin-1和VP1之间的相互作用。最后，我们发现蛋白酶体功能也与BKV感染和衣壳重排有关。这些结果表明，BKV早期进入和拆卸是涉及多个细胞成分的高度调控过程。

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数字

图1。
图1。
RPTE细胞中的BKV感染需要低H步骤。RPTE细胞经模拟处理或6.25 mM NH处理4在37°C下氯化2小时。在37°C的温度下，以0.5或5 IU/细胞的MOI感染细胞BKV 1小时，并加入药物。1小时后取出接种物，并将含有药物的新鲜培养基添加到细胞中。感染48 h后固定细胞，用间接免疫荧光染色法观察感染细胞。（A） 表示5IU/单元的MOI的单元字段。（B） 感染细胞的百分比与未处理样品的百分比标准化。每个条形代表三个独立实验中七个随机场的平均值。误差条是标准偏差值。
图2。
图2。
BFA阻断RPTE细胞中的BKV感染。对RPTE细胞进行模拟处理或在37°C下用1.25μg/ml BFA处理2 h。然后清洗BFA，用纯化的BKV感染细胞，MOI为0.5或5IU/细胞，37°C下感染1h。用新鲜培养基替换接种物，并在感染后48 h对细胞进行TAg染色。（A） 表示5IU/细胞的MOI的细胞场。（B） 感染细胞的百分比与未经处理的样本进行了标准化。每个条形代表三个独立实验中七个随机场的平均值。误差条是标准偏差值。
图3。
图3。
RPTE细胞中BKV贩运的时间进程。RPTE细胞在4°C下用纯化的BKV在0.5 IU/细胞的MOI下吸附1 h。同步感染是通过将细胞移到37°C开始的。感染后指示小时数（hpi），NH4向细胞中添加Cl（A）、BFA（B）或诺卡唑（C）。在感染后48小时收集总细胞蛋白，并通过Western blotting分析TAg的表达。
图4。
图4。
RPTE细胞中BKV衣壳重排动力学。RPTE细胞以5IU/细胞的MOI感染BKV，并在指定的hpi下，在材料和方法中描述的烷基化条件下制备总蛋白裂解物。在非还原或还原条件下分离蛋白质，并探测VP1和GAPDH。显示了全长VP1和两个假定的解理产物VP1*和VP1**的位置。
图5：。
图5：。
BFA和NH的影响4Cl对BKV衣壳重排的影响。RPTE细胞与BKV在4°C、MOI为5 IU/细胞的条件下孵育1小时。吸附1小时后，将细胞保存在新鲜培养基或含有BFA或NH的培养基中4Cl.在12 hpi的烷基化条件下分离总蛋白，在非还原（A）或还原（B）条件下分离，并探测VP1和GAPDH。
图6。
图6。
BKV感染需要Derlin-1。（A） 用Derlin-1-YFP或Derlin-2-YFP瞬时转染RPTE细胞，并在转染24 h后以0.5 IU/cell的MOI感染BKV。细胞固定并在48 hpi下进行TAg染色。YFP阳性细胞中TAg阳性细胞的百分比归一化为未转染细胞的百分比。每个条形图表示三个独立实验结果的平均值，误差条形图表示标准偏差值。（B） GST或GST-VP1与谷胱甘肽Sepharose珠结合（输入如左图所示），并与500μg未感染的RPTE细胞提取物孵育。从珠子中回收的蛋白质复合物被探测Derlin-1（右）。左侧车道显示了5%的RPTE单元提取输入。
图7。
图7。
蛋白酶体参与BKV感染和衣壳重排。（A） RPTE细胞在4°C下以5IU/细胞的MOI感染BKV。感染1小时后，将细胞保存在新鲜培养基或含有20μM乳酸菌素的培养基中。采集24 hpi的总蛋白，并通过Western blotting分析TAg的表达。（B） RPTE细胞以5IU/cell的MOI感染BKV，并用lactacystin处理。在12 hpi的烷基化条件下制备总蛋白裂解物，并按照图5的图例进行分析。
图8。
图8。
RPTE细胞中BKV进入的建议模型。（A） BKV在小窝介导的内吞作用后进入酸性区室，在那里低pH值触发衣壳内的构象变化，开始分解过程。（B） BKV进入pH-中性小泡体。（C） BKV沿着微管运输到内质网，在那里它与Derlin-1相互作用以逃逸出内质网。内质网中可能会发生某些构象变化（用虚线病毒粒子表示）以帮助逃逸过程。（D） BKV进入一个未知的隔间，在那里VP1二硫键重排和裂解发生。BFA或lactacystin治疗将BKV导向此途径。病毒是否通过ERAD途径（E）进入蛋白酶体尚不清楚。
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